质粒DNA基因治疗药物的定义

基因治疗产品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，根据基因载体类型的特性差异，基因治疗产品主要可分为以病毒为载体的基因治疗产品、以质粒 DNA 为载体的基因治疗产品、RNA 类基因治疗产品，以及以细菌微生物为载体的基因治疗产品，其通过在人体细胞内，利用“细胞工厂”进一步表达产物或编辑细胞基因发挥功能^[1]。

质粒DNA基因治疗药物是以质粒DNA为载体的基因治疗产品。天然质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分，绝大多数为环形双链DNA分子，能持续稳定地游离于染色体外自主复制，也可能在一定条件下可逆地整合到宿主染色体上随染色体的复制而复制，因此是基因克隆中最常见的载体分子^[2]。质粒本身可以携带外源目的基因用于质粒DNA基因治疗药物的开发，也是CAR-T、mRNA等细胞与基因治疗药物的基本原料，而且随科学技术的发展，质粒在医药、农业和环保、食品等领域都有了广泛应用。

质粒DNA基因治疗药物发展历程

基因治疗是随着20世纪六七十年代DNA 重组技术、基因克隆技术等的成熟而发展起来的最具革命性的医疗技术之一，1972年Friedmann等^[3]首次提出采用基因疗法作为治疗人类遗传疾病的手段，而质粒DNA在生物制药领域发展的突破性进展出现在1990年，Wolff等^[4]将含有氯霉素乙酰基转移酶、萤光素酶和β-半乳糖苷酶基因的质粒盐溶液注入到小鼠的骨骼肌中发现，在这种“裸”质粒DNA分子中编码的报告基因在肌肉细胞中表达，该重大发现开启了将质粒DNA作为生物药物用于治疗或预防的可能性。纵观近30年的发展，质粒DNA基因治疗药物发展可以分为技术手段发展、临床试验探索以及上市应用3个阶段（见图1）。

图1. 质粒DNA基因治疗药物的发展历程

1994年，代号AT-0001的治疗质粒DNA基因治疗药物（目的基因为IL-2）在澳大利亚开展I期临床试验，用于恶性黑色素瘤的治疗，之后几年，研究者们陆续开展了临床尝试，大都宣告失败。2001年，代号JP-0010的质粒DNA基因治疗药物（目的基因为HGF）在日本开展I/II期临床试验，用于外周动脉缺血性疾病的治疗（该药物于2019年获得日本有条件上市批准）。截至2010年，质粒DNA基因治疗药物数量的临床试验累计达到约300个，约占基因治疗临床试验总数量的18%，适应症包括肿瘤、心血管疾病以及传染病等多个领域，尤其在缺血性疾病方面，质粒DNA基因治疗显示出较好的应用前景。

2011年，俄罗斯干细胞研究公司开发的血管内皮生长因子（VEGF165）裸质粒基因治疗药物（商品名为Neuvasculgen），在俄罗斯获批上市，用于治疗动脉粥样硬化引起的外周动脉缺血性疾病；2019年，日本AnGes公司开发的重组人肝细胞生长因子（HGF）裸质粒基因治疗药物（商品名为Collategene），在日本获得有条件上市批准，用于治疗阻塞性动脉硬化症和血栓闭塞性脉管炎；2021年，印度Cadila 公司开发的DNA疫苗ZyCoV-D获得紧急授权许可，用于预防12岁以上人群的重组2019新型冠状病毒感染。ZyCoV-D是世界上第一个被批准用于人类的DNA疫苗，预示着针对各种疾病的DNA疫苗的到来。

质粒DNA基因治疗药物研发现状

截至2022年4月份The journal of gene medicine的统计结果^[6]，全球范围内质粒DNA基因治疗药物的临床试验共开展482个，占基因治疗临床试验总量的14.7%，仅次于以腺病毒以及逆转录病毒为载体的基因治疗临床试验数量（见图2）。

图2. 各载体类型的基因治疗药物临床试验分布

从目的基因角度分析，基因治疗药物使用的目的基因包括受体、抗原、细胞因子等，而质粒DNA基因治疗药物的目的基因主要集中于抗原、血管生长因子以及细胞因子，其中以抗原为目的基因的DNA疫苗的临床试验方案数量最多，占比约36%，主要用于肿瘤及感染性疾病的治疗，血管生长因子类的数量次之，占比约21%，主要包括成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）等，具有促进血管新生的作用，主要用于治疗缺血性疾病。

从研发阶段上分析， 基因治疗药物的临床试验超过50%为Ⅰ期阶段，进入Ⅲ期的临床试验数量仅不到5%， 质粒DNA基因治疗药物所处各临床试验阶段的比例同上述数据基本一致，其中处于Ⅰ期临床试验阶段的超过250个，处于Ⅲ期阶段的仅有约20个方案，表明质粒DNA基因治疗药物仍然大部分处于临床研究的早期阶段。

质粒DNA基因治疗药物的主要特点

基因治疗产品中，以病毒和质粒DNA为载体的基因治疗产品最为常见，RNA为载体的制品虽然仅占2%的比重，但随COVID-19 mRNA疫苗的上市，mRNA技术平台在2020年取得重大突破。与病毒载体的基因治疗药物相比，质粒DNA基因治疗药物基本不存在基因整合风险，无免疫原性问题，安全性更高；与mRNA药物相比，质粒DNA基因治疗药物认为具有更高的安全性，且生产过程简单，产品稳定性更好，对运输、存储要求更低。上述三类基因治疗产品的特点如表1所示。

表1. 病毒载体、质粒DNA以及mRNA基因治疗药物特点

质粒DNA基因治疗药物研发的关键技术

同其他生物工程药物相比，质粒DNA基因治疗药物开发历史较短，在制备工艺开发及产业化方面仍存在技术瓶颈，且其活性成分为质粒DNA，转染效率低、目的产物表达量低、质粒构象不稳定等特点都给药物研发带来很大挑战。质粒DNA基因治疗药物的药学开发主要包括重组质粒构建、工程菌筛选、发酵、纯化以及质量控制等方面，涉及的关键技术主要有以下方面。

重组质粒的构建主要包括目的基因设计以及载体构建两部分（见图3）。

图3. 重组质粒的构建

目的基因设计直接关系到目的蛋白的表达量，根据表达产物的氨基酸序列，设计出目的基因的密码子并进行优化，需要考虑密码子的偏好性、协调性以及敏感性等因素，并根据目的蛋白的表达位置确定是否需要信号肽。

载体构建包括复制子序列、抗性基因、启动子、终止子等。质粒DNA基因治疗药物通常选择大肠杆菌等微生物作为宿主细胞，因此要求质粒能在原核细胞中大量复制，在真核细胞中高效表达。复制起始位点的选择与质粒DNA的产量密切相关；启动子和终止信号关系到目的基因在真核细胞中是否能够高效稳定表达。

不同研究者或研究单位会选择不同的元件组合来构建载体，不同载体构建的重组质粒的转染效果和目的基因表达率可能差异较大，因此重组质粒的构建和筛选是质粒DNA基因治疗药物研发成功与否的前提条件。

通过发酵收获含有目的产物的菌体后，需要通过前处理工艺将目的产物从菌体中释放出来，因此前处理工艺直接影响到后续精纯化工艺，以及残余杂质尤其是外源DNA的残留量，并且对于质粒DNA药物来说，不同质粒构象将直接影响到产品质量，因此前处理工艺至关重要。

质粒DNA基因治疗药物小试及中试规模的生产工艺研究较多，发酵规模多为100L以下。规模化生产时，发酵过程中工程菌的稳定性，目的质粒的产量，质粒丢失率等问题凸显；菌体的规模化前处理更具有挑战性，质粒对剪切力较为敏感，需要全程考虑；纯化过程中由于目前大部分层析介质是针对重组蛋白质设计的，而质粒分子量较大，难以进入介质的孔隙，导致介质载量较低。因此，规模化质粒制备技术开发仍然是一个较大的挑战。

质量标准的制定直接关系到产品的质量控制，从产品纯度角度，环形双链的质粒DNA分子主要有超螺旋、开环以及线性三种构型（见图4），超螺旋构型质粒与产品活性密切相关，因此超螺旋质粒的检测方法及其比例是质粒DNA基因治疗产品质量控制的重点；从产品杂质角度，需要对细菌内毒素、宿主菌蛋白质残留量、外源DNA残留量及残余RNA等方面进行严格控制。目前FDA及欧盟尚未批准以质粒DNA为载体的基因治疗药物，因此质量指标的选择以及标准的设定均缺乏较为权威的参考，需要进行大量的研究。

图4. 质粒DNA构型（原子力显微镜图）