基因疗法作为强大且潜在的治愈性疗法对于各种其它方式难以治疗的疾病具有很大的应用前景。重组腺相关病毒(rAAV) 是目前基因治疗领域体内治疗的首选载体。rAAV 是一种安全有效的治疗性基因递送工具，因为它缺乏致病性、无法自主复制以及能够转导分裂和非分裂细胞。迄今为止，超过200 项正在进行或已完成的基因治疗临床试验使用rAAV 来递送治疗性基因，并且这一趋势在最近十年继续增加。

大规模生产 rAAV 以支持临床试验和商业化应用仍然是基因治疗领域的主要瓶颈。目前，基因治疗中最常用的三种rAAV 生产平台是瞬时转染、杆状病毒表达载体（BEV) 系统和生产细胞系 (PCL) 系统。不同 rAAV 生产平台之间的许多不同的生产挑战与细胞培养过程和其中使用的关键生物材料有关。相比之下，下游纯化工艺和规模放大策略通常更具平台化和系统之间的可转移性。因此，本文将重点关注瞬时转染、BEVS和 PCL rAAV 生产平台的细胞培养规模放大挑战。

当前的 AAV 生产平台以及规模放大的挑战

瞬时转染 (TT)

瞬时转染 (TT) 是最广泛使用的 rAAV 生产方法之一，因为它具有快速的开发周转时间以及生产各种rAAV 构建体的灵活性。在 TT 系统中，生产 rAAV 的遗传元件，包括复制和衣壳蛋白功能(rep/cap)、目的基因 (GOI) 和辅助功能，被编码在质粒 DNA (pDNA) 中，并通过化学试剂递送到哺乳动物细胞中。常用的转染试剂包括磷酸钙、阳离子脂质和聚阳离子。聚乙烯亚胺(PEI) 是大规模生产 rAAV 最流行的转染试剂，因为它具有高效、长期储存稳定、经济可行的优势。TT的生产工艺开发工作一直集中在细胞系工程和克隆筛选、质粒配置改进和工艺优化上，以进一步提高rAAV 生产力、工艺稳健性和工艺可放大性。

贴壁瞬时转染 (aTT) 主要用于学术环境中的小规模 rAAV 生产和物料制备，以支持小规模临床试验。这部分是由于aTT 工艺的简单性以及使用 aTT时可观察到的高细胞特异性生产率。通过将质粒更为为不同的目标 GOI，同一宿主细胞系可用于生产多种构建体；这大大缩短了筛选和开发时间。这种灵活性和易于实施也使aTT 成为生成早期物料的理想平台。此外，对于药物需求量相对较低的疾病，例如视网膜变性，aTT可以合理地用作商业化 rAAV 生产过程。尽管如此，aTT 工艺的可放大性和生产一致性的维持已被证明具有挑战性。为了解决这些规模放大挑战，生产容器设计，如HYPERStack® (Corning) 细胞培养容器以及最近的iCellis™ (PALL) （和scale-X（Univercells））固定床反应器已经被行业所采用，以增加容器表面积并提供利用aTT 的潜力进行大规模 rAAV 生产的机会。然而，使用 aTT 生产rAAV 是极其劳动力密集型的，并且需要大量的操作员操作；这可能会导致批次间一致性差，并使工艺验证难以执行。

悬浮瞬时转染 (sTT) 能够更直接地在搅拌罐生物反应器 (STR) 中进行细胞培养的规模放大，同时降低液体操作要求，因此是一种更理想的解决方案。尽管有人担心sTT 中的细胞特异性生产率低于 aTT，但在许多情况下，相比aTT，整体rAAV 产量和可放大性优势仍然支持将 sTT 作为的首选选项。此外，近年来行业已投入大量研究和资源，以进一步改进 sTT 工艺。多个研究小组最近报告成功开发了具有大于 1e5 病毒基因组 (vg)/细胞生产力、大于1e14 vg/L 滴度的细胞系，并成功放大到了数百升规模的生物反应器。

将 PEI 添加到质粒 DNA 以形成基因递送纳米颗粒的复合步骤是sTT 工艺可放大性的另一个众所周知的挑战。这些纳米颗粒极不稳定；时间依赖性的颗粒形成可导致细胞摄取和转染效率降低。然而，最近对PEI/pDNA 复合物基本动力学的研究和理解已被用于推动大规模转染的进步。

杆状病毒表达载体（BEV）系统

在 BEV 系统中，rAAV 通常是通过分别提供rep/cap 和 GOI 基因的两种重组杆状病毒对昆虫细胞 (sf9) 的共感染产生的。BEVS系统可提供多方面的优势 – 可直接规模放大至更大的体积、相比哺乳动物细胞培养平台更高的单位体积生产率，并且不含动物源性成分。尽管有这些优势，但人们担心使用多种杆状病毒构建体的共感染会导致载体蛋白VP1、VP2 和 VP3 比率不一致。与哺乳动物细胞培养产生的rAAV 相比，BEV 系统生产的 rAAV 还可以表现出不同的翻译后修饰，这可能会影响最终rAAV 产品的感染性。此外，长期的杆状病毒库供应受到高病毒库需求以及遗传不稳定性的阻碍，妨碍了BEV 系统在大规模 rAAV 生产中的广泛使用。另外，由于没有利用杆状病毒的成熟合同制造组织 (CMO)，杆状病毒的良好生产规范 (GMP) 生产受到限制。

生产细胞系（PCL）

这种策略最初于 25 年前报道，生产 rAAV 的生产细胞系(PCL) 生产了第一个基于 rAAV 疗法的成人囊性纤维化人体临床试验的物料。PCL 系统被认为是最具成本效益、稳健和可放大的生产平台。在 PCL 中，rep/cap 和GOI 元件可以稳定地整合至宿主细胞中（例如HeLa细胞），然后可以通过辅助病毒感染诱导重组AAV 的产生。使用 PCL 成功放大 rAAV 生产的策略已在250L 和 2000L 规模上得到证明。虽然 PCL 系统为rAAV 生产提供了一种更具可放大性和稳定性的方法，但它们的主要缺点是生成稳定细胞系所需的大量时间和资源。除了需要当前良好生产规范 (cGMP)生产细胞库外，cGMP 病毒原液（例如腺病毒）对于基于辅助病毒的 PCL 也是必不可少的。虽然与 BEV 系统类似，没有成熟的CMO可进行(cGMP) 病毒原液的增殖，但腺病毒原液将与工艺无关，并且对于大规模生产更稳定。在辅助病毒PCL 系统中，辅助病毒本身是不受欢迎的工艺杂质，增加了下游rAAV 工艺的负担。

随着基因治疗应用向更大患者群体和高剂量适应症发展，将需要更高产量和更低成本的工艺。最近，出现了一种可诱导生产细胞系(iPCL) 平台，该平台有可能实现可放大、稳健且高产的工艺。诱导型基因表达系统利用化学诱导型启动子，其基因表达基于添加化学诱导剂而开启或关闭。这些类型的系统已在各种其它基础应用研究领域中得到广泛探索。诱导表达可以减少组成型基因表达的副作用，例如模型系统中的细胞死亡和生长延迟。事实上，在单克隆抗体生产过程中已经报道了多个iPCL 案例研究。该技术最近也被应用于基因治疗领域，开发了一种专有的稳定生产细胞，其中包含生产rAAV 的所有必要元件（rep/cap、GOI 和辅助功能）。该系统利用四环素诱导型启动子，并通过小分子强力霉素诱导生产。通过使用基因表达开关，rAAV生产可以分为两个阶段：细胞生长期和病毒载体生产阶段。在细胞生长期，可以采用高细胞密度工艺（补料分批或灌流）来提高生物量。使用基于灌流的生产工艺生产的AAV8-GFP 载体的早期概念验证研究表明，其可支持在诱导时获得更高的生物量并获得更高的单位体积生产力。

尽管 iPCL 具有可放大性和低成本优势，但在 GMP 生产中实施之前仍存在一些挑战。与基于腺病毒的 PCL 系统一样，可诱导细胞系构建可能比实施 sTT 工艺更加劳动力密集。此外，用于临床生产的细胞系尚未证明细胞系稳定性。细胞扩增过程中基因拷贝数的变化或基因表达的丢失可能会影响最终产量和产品质量。

总结

没有生产系统是完美的。此处评估的每种rAAV 生产平台都具有优势和挑战，如表 1 所示。在确定项目的“最合适”生产平台时，重要的是首先评估整体产品需求、临床试验时间线、目标患者群体规模，然后重新考虑与每种rAAV 生产平台相关的收益和风险。例如，TT系统实施速度快，但规模放大具有挑战性且成本高昂，而PCL 系统可放大性良好且具有成本效益，但稳定细胞系的生成可能很耗时，并且需要额外的专业知识。因此，TT系统将更适合时间紧迫且药物需求相对较低的项目，而PCL 系统将是产品需求高和工艺开发时间较长的项目的选择。

表1. 当前最常用的rAAV生产系统的优势和规模放大挑战总结

最后一点是，基因治疗领域仍在了解生产平台和工艺参数对rAAV 产品安全性和有效性的影响。在制定更明确的指导方针以确保一致的产品质量之前，在从首次人体临床试验转向关键临床试验和商业化生产之前，如需切换生产平台，应谨慎评估。

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原文：J.Shupe, A.Zhang, D.C.Odenwelder, et al., Gene therapy: challenges in cell culturescale-up. Current Opinion in Biotechnology, 2022, 75: 102721.