生物药在转基因细胞中产生；因此，它们含有与工艺和产品相关的杂质。那些来自生产过程的杂质包括宿主细胞DNA / RNA、病毒DNA / RNA、细胞碎片、脂质和宿主细胞蛋白（HCP）。哺乳动物、细菌、真菌、昆虫和植物细胞系已被用于过表达重组蛋白。目前，最常用于生物分子合成的宿主是E.Coli和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
自生物技术行业开创以来，E.Coli一直用于生产异源蛋白质。这种表达系统很有吸引力，因为它使用廉价的培养基即可快速、高效地生长。它还可基于高拷贝质粒产生大量蛋白质。虽然在该物种中表达的异源蛋白质没有糖基化，但如果它们的氨基酸序列与人类蛋白质的氨基酸序列相同，它们仍然可以引发相应的生物反应。因此，可以采取几种不同的策略来预防蛋白-表达问题。
目前，CHO细胞是异源蛋白质最常用的表达系统。Theodore Puck于1957年首次培养了这种细胞。这项工作开创了生物技术的新时代。在此之前，中国仓鼠被认为只对实验设计有用。这些细胞可以表达具有糖基化模式的蛋白质，这些模式与它们的人体对应物足够相似，以产生相同的生物活性。
目前的纯化工艺不能产生完全不含HCP的生物药物底物。问题主要来自宿主细胞的复杂基质：E.Coli和CHO基因组分别包含约4,288和25,000-30,000个蛋白质编码基因。分离和纯化工艺基于生物药的物理化学性质，因此HCP与具有相似物理化学特性的治疗性蛋白质一起洗脱的可能性很大。
图1：宿主细胞蛋白（HCP）对蛋白质药物疗效和安全性的影响和假定作用（IgE =免疫球蛋白E抗体；BAb = 结合抗体；NAb = 中和抗体）。
这些杂质可能会引起对药物 - 产品功效和安全性的担忧，具体取决于其性质和水平。一些研究将HCP含量确定为关键质量属性（CQA），通常在生物药生产过程中用作基准。潜在风险包括蛋白酶、糖苷酶、脱酰胺酶和氧化活性，以及患者的免疫原性反应。图1描述了HCP对疗效和安全性的假定影响。
在本文中，我们将总结相关的监管框架，并详细介绍HCP对生物功效的潜在影响。
HCP = 宿主细胞蛋白；RP = 反相；UHPLC = 超高效液相色谱；SE = 体积排阻；CEX = 阳离子交换；AEX = 阴离子交换；HILI = 亲水相互作用；PV = 药物警戒；HIC = 疏水相互作用；FLR = 荧光；2D = 二维；LC-MS/MS = 液相色谱与串联质谱。
法规：设置限值
由于HCP会损害患者安全，国际指南已经建立了此类杂质的限值和控制（图2）。美国联邦法规（CFR）规定，生物药必须“不含外来物质，除非是不可避免的物质”。ICH Q6B <2.1.4>关于规格：生物技术/生物药的检测程序和验收标准规定如下：
药物底物中的工艺相关杂质可能包括细胞培养基、宿主细胞蛋白、DNA、单克隆抗体或纯化中使用的层析介质、溶剂和缓冲液成分。这些杂质应该通过使用适当的、控制良好的生产工艺来最小化。
应酌情设定杂质（产品相关和工艺相关）的单独和/或总体验收标准。在某些情况下，选定杂质的验收标准可能不是必需的（第2.3节）。
世界卫生组织（WHO）建议如下：工艺验证研究应包括对工艺和工艺步骤的适当评估…并提供证据证明它们能够始终如一地提供优质的产品和中间体。
然而，同样的指南指出，“对于某些杂质，常规检测可能没有必要，这些杂质已被证明可以达到高降低水平。”欧洲药典补充说，HCP限值“必须得到主管当局的批准”。
根据这些段落，很明显，监管指南没有规定允许的HCP限值，可能是因为此类杂质是多种多样的，在药物产品中含量低，并且通常仅引起极低的免疫原性问题。一些研究提到1-100 ppm是HCP的普遍可接受范围。但是，该范围不是官方的。
美国药典第<1132>节列出了“生物制药中残留宿主细胞蛋白检测”的要求，将限值描述为“拒绝限值”，或药物产品被认为不适合使用的测量值。这些限值基于临床数据。
对功效的影响
酶活性对糖蛋白有害。蛋白水解、糖苷键的水解、脱酰胺和二硫键还原是与HCP相关的一些例子。
蛋白酶活性：蛋白酶可细分为丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶家族，所有这些都会降低蛋白药物性能。蛋白水解酶，如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，通常靶向蛋白质和抗体的非结构化铰链区域。由于上游和下游工艺会产生无数的蛋白酶，因此选择合适的蛋白酶抑制剂是生物制药行业的常见做法。这种抑制剂按大小分类：例如，小分子（苯甲基磺酰氟）、肽（E-64）和蛋白质（抑肽酶）
Gao等人已经在IgG1单克隆抗体（MAb）药物底物中鉴定出胃蛋白酶相关的蛋白水解活性。该团队写道，材料是使用Protein A亲和层析和正交精纯步骤纯化的。将样品在40°C、pH 4-6下孵育20天。将胃酶抑素A施用于一些样品，以抑制蛋白水解。使用尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）检测酶相关的MAb片段化。
研究小组发现，0.5 μg/mL的胃酶抑素A浓度阻止了加标样品中的蛋白水解，并且只有水解活性在药物底物中持续存在。胃蛋白酶在pH 4时有活性，但在pH 6时活性下降。水解活性的研究结果相似，在pH 4时增强，但在中性pH下最小化。值得注意的是，即使在pH值为6的胃酶抑素A存在下，mAb水解仍然存在，尽管该活性较低。
在pH 4、40°C下孵育20天是检测生物技术产品稳定性的罕见程序。这些条件通常不会在纯化工艺过程中应用，因此在稳定性检测期间也不会使用 - 不像在pH 7、37°C下孵育15天那样频繁。但是，这种“加速应力测试”是一种“智能”方法，可以防止长期产品保质期的问题。在4°C的冻干药物产品中，分子降解过程比40°C时慢。因此，蛋白水解活性可能未被发现。
Robert等人的一项研究在另一种mAb产品的药物底物中发现了2种生物工艺源性蛋白酶。其中一种酶是组织蛋白酶B的同源物。另一种被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制，因此是金属蛋白酶。
研究人员已经概述了细胞活性、pH优化、适当控制培养温度和及时蛋白质收获的重要性。这些因素的控制凸显了细胞碎片降低分泌到培养基中的重组蛋白的质量的可能性。
根据所应用的表达系统，可以产生许多类型的蛋白酶：1,436种蛋白酶来自E.Coli、216种来自酿酒酵母、125种来自毕赤酵母。这种多样性为生物技术产品的纯化带来了障碍。
因此，蛋白酶抑制剂经常在生物工艺过程中使用，特别是当重组蛋白来自包涵体时。在这种情况下，残留的蛋白酶活性会污染和/或降解产物蛋白。因此，在过去的40年中已经开发了许多抑制剂，包括市售的多种混合物。
虽然蛋白酶是在工艺过程中产生的，但它们可以在药物开发、稳定性研究和质量控制分析期间进行跟踪。然而，像Gao等人这样的案例研究必须考虑在内，因为蛋白酶活性会损害药物-产品功效。
糖苷酶活性：研究人员已经在酸性pH水平下证明了β -半乳糖苷酶、己糖胺酶和岩藻糖苷酶活性。Gooche等人还在pH 7.5的CHO细胞培养上清液中检测到了唾液酸酶活性。这样的工作表明，上清液中的糖苷酶活性可以增加糖蛋白异质性。因此，唾液酸酶活性已成为直接影响mAb产物药代动力学的相关CQA。
脱酰胺酶活性：Lee等人最近使用纳米流LC-MS分析了HCP蛋白质组学。他们的实验在来自CHO细胞的补料分批培养的上清液中检测到了2,145种HCP。一种已确定的物质是豆荚蛋白（Lgmn），一种溶酶体蛋白酶，可从mAb中的天冬氨酸氨基酸中去除酰胺基团，从而改变它们的酸度特性。值得注意的是，Lgmn在所测上清液中30种最丰富的HCP中排名第六，约占HCP总质量的2%。
研究人员还检测到了组织蛋白酶A、B、D、L和Z（CTSZ），所有这些都可以切割C端重链碎片。在这些蛋白酶中，CTSZ在所测上清液中丰度较高（在30种最丰富的HCP中排名第20位）。该团队还检测到另外2种具有糖苷酶活性的蛋白质，即β-半乳糖苷酶1（GLB1）和β-1,4-半乳糖基转移酶（B4GALT1）。该团队认为，HCP的浓度与mAb质量属性相关。CHO细胞将大量此类杂质分泌到培养基中。
二硫键还原：剪切力会影响蛋白质产品生产过程中产生的杂质数量。Trexler-Smith等人使用非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来研究受剪切应力影响的IgG1 MAb的重链和轻链。研究人员发现了显著的二硫键还原。然而，他们确定可以在上游工艺过程中防止还原酶形成，并在必要时，在Protein A捕获步骤中消除。
HCP监测的重要性
我们对以往在HCP领域的研究的回顾强调了考虑与工艺性能相关的因素的必要性。在我们讨论的例子中，即使是微量的蛋白酶、糖苷酶、脱酰胺酶和还原酶，对治疗性蛋白质也是有害的。幸运的是，可以使用最先进的科学分析方法（例如阳离子交换（CEX）、阴离子交换（AEX）和疏水相互作用（HI）色谱方法，包括应用超高效液相色谱（UHPLC）技术和/或与质谱（例如，LC-MS、UHPLC-MS）的组合，来密切跟踪这些酶的活性。
免疫原性、过敏反应、抗药物抗体 （ADA） 和生物活性的风险不能像监测蛋白酶、糖苷酶、脱胺酶和还原酶相关的风险那样容易监测。因此，区分蛋白质产品的理化质量属性和免疫原性特征非常重要。
