废弃液（Bleed）循环是一种通过浓缩工艺废弃液、以选择性去除生物质并循环液体部分，来提高稳态灌流工艺产量的新方法。这导致显著的产品节省，后者否则将被浪费。只要能对细胞进行浓缩分离，现有的细胞分离装置都可以用于此类应用。然而，比较废弃液循环应用的操作模式和效率的信息有限。倾斜重力沉降首次被用作废弃液循环技术，并与声学分离进行了比较。除了较低的碎片去除率外，倾斜重力沉降显示出相似的废弃液循环效率，并且对细胞活性、营养和代谢物水平以及产品质量没有负面影响。此外，考虑到降低系统复杂性以及便于规模放大，倾斜重力沉降是在 42 天实验室规模灌流工艺中进一步评估的首选技术。实现了高达 3.5 倍的废弃减低以及 19% 的平均收获率提升。随后使用适用于 2,000 L 灌流工艺的大型倾斜重力沉降器测试了可放大性，以确认实验室规模实验的性能。来自筛选实验的废弃液循环特征数据与可放大性论证相结合，有助于在考虑新灌流工艺设置的废弃液循环以减少灌流浪费、提高工艺可持续性和提高整体工艺产量时做出决策。
废弃液循环是一项通过减少废物流（工艺废弃液）来最大化稳态灌流产量的新技术。因此，将声学分离与倾斜重力沉降进行比较，以评估它们在各种工艺条件下进行连续废弃液循环操作的适用性。两种技术均未观察到对工艺代谢物和产品质量的影响，同时显著提高了工艺产量。随后扩大 2,000 L 灌流工艺，证实了实验室规模的实验结果。
最近关于灌流细胞培养的报道显示其单位体积生产率增加、产品质量更均匀，以及由于不稳定蛋白质在生物反应器中的产品停留时间减少而带来的好处。单克隆抗体的连续生产包括稳态灌流细胞培养过程，随后是连续捕获步骤和多个精纯步骤。为了实现稳态灌流操作，不仅需要用于无细胞收获的细胞截留装置 (CRD)，还需要用于去除过多生物质的废物流（废弃液，Bleeding）。废弃不是选择性操作，因为废弃与生物反应器中的培养物具有相同的成分。假设工艺活细胞体积 (VCV) 为10%，意味着 10% 生物质和 90% 液体部分的废弃组合物。由于在稳定的灌流工艺中需要通过废弃操作来维持目标细胞密度，这会导致大量液体（含有目的产品）与过多的生物质一起被浪费。
在计算灌流工艺的产量时，必须考虑产物浓度（收获滴度）和收获率。因此，过高的废弃率在工艺强化方面是不受欢迎的，因为它们会导致收获率降低。尽管行业内收获滴度有了重大改进，但很少有人关注灌流废弃液率的降低。
提高工艺产量的第一个策略包括降低整体工艺废弃率。文献报道了细胞周期抑制剂或温度变化对生长的抑制。尽管提高了工艺产量，但生长抑制会导致产品质量发生变化。此外，废弃率对应于细胞分裂率。虽然低细胞分裂率最初可能会提高工艺产量，但这种方法可能会危及细胞培养的长期高活性和稳定性。
第二种策略是浓缩废弃液流、以减少伴随废弃液流中的生物质而被浪费的液体部分。只有浓缩的生物质被直接处理成废物，澄清的液体被引导回生物反应器，从而提高灌流收获率和工艺产量。来自生物反应器的废弃流对应于细胞分裂率，在这种情况下没有减少，但其中很大一部分液体被循环回生物反应器。因此，最近进行了一项概念验证研究，该研究使用声学分离器实施固液分离步骤，以浓缩灌流工艺废弃流中的生物质，并将其指定为废弃循环。在 5% 的 VCV 下，在 2 L 规模下测试了 4 天的时间，检测到良好的分离效率，并且产品质量或代谢物概况没有变化。液体-固体分离装置，而不是生长抑制，可以通过在不降低培养性能的情况下保持足够高的废弃率，从而降低长期工艺稳定性的风险。Bielser 等人的研究是文献中关于废弃液循环的第一份报告，需要进一步研究，以探索其在较高 VCV 和不同灌流工艺条件下的潜在益处。此外，尚未证明用于废弃液循环的声学分离的可放大性。
声学分离器使用声学共振场，使个体细胞聚集在一起，并形成更大的细胞聚集体。这些细胞聚集体由于尺寸较大而显示出增强的沉降特性，并且一旦声波中断，就会更快地沉降。虽然在小规模操作中使用声学沉降器作为 CRD 可以获得非常有前途的分离结果，但关于声学分离器的大规模应用的信息有限。声学分离器已成功测试用于澄清体积高达 200 L/day，并建议通过合并多个较小的声学室进一步扩大规模。开发更大规模的声学分离器似乎非常困难，因为细胞分离需要大量的功率输入，导致设备内产生热量。多室系统可能会解决散热问题，但会大大增加系统的复杂性，因此需要探索更多技术作为废弃液循环的替代方案。这些技术应该不那么复杂，更容易放大，但表现出相似的性能特征。
除了声学分离，倾斜重力沉降已成功用作 CRD 以维持稳定的灌流过程。与声学分离器相比，倾斜重力沉降器被广泛研究并用于大规模生产生物反应器，因为它们的复杂性相对较低，且具有良好的可放大性，使它们成为用于废弃液循环的声学分离的有趣替代方案。当颗粒（在本例中为细胞）在倾斜通道内沉降时，在通道底部形成更高密度的浆液。在重力的驱动下，浆液从表面滑落，产生增强沉降过程的对流，被称为“Boycott 效应”。由于没有声学共振场的聚集支持，倾斜重力沉降器往往比声学分离器大。这伴随着倾斜重力沉降器内培养物停留时间的增加，在用于废弃液循环时，对培养性能的影响未知。
由于沉降技术不能保证 100% 澄清的培养收获，这导致广泛使用基于过滤器的细胞截留装置，主要使用基于中空纤维组件的切向流过滤 (TFF) 和交替式切向流 (ATF) 技术，废弃液循环的工艺要求不同。在废弃液循环的情况下，循环装置的主要目的是尽可能多地浓缩细胞而不是提供完整的无细胞收获流。澄清的循环液流，即使含有一些剩余的细胞，也将被引导回生物反应器并最终增加收获流。用于进一步下游工艺操作的过滤由主细胞截留装置执行，而不是由废弃液循环装置执行。由于不仅整个细胞而且更小的颗粒（如细胞碎片）都可以循环到生物反应器中，因此应研究细胞碎片对细胞截留过滤器污染的可能负面影响。定义关键工艺碎片水平和与过滤器污染的相应相关性尚未得到证实，并且很可能会根据所选的工艺参数、设备和操作模式而变化。
本研究的目的是证实废弃液循环在工业相关灌流工艺强化中的应用。倾斜重力沉降首次用作废弃液循环装置，并在废弃液循环效率、代谢物概况、产品质量属性、细胞碎片去除和操作简便性方面与声学分离进行了比较。在实验室规模研究了涵盖工艺 VCV、工艺废弃率和沉降器操作参数的各种灌流方案，以量化通过废弃液循环对各种情况进行工艺强化的潜力。通过建造一个大型倾斜重力沉降器和循环 2000 L 灌流生物反应器废弃流，证明了废弃循环的可放大性。报告了成功结果的详细信息，重点关注了废弃液循环技术的性能，更重要的是，还关注了废弃液循环对细胞培养性能和产品质量的影响。
详细试验操作和结果，请参考原文。
中试规模灌流细胞培养
一种生产双特异性单克隆抗体 (mAb2) 的专有 CHO-K1 细胞系在 200 L 灌流生物反应器（Mobius 200 L 生物反应器，Merck KGaA）中培养。VCV 使用在线电容探针（Incyte Arc，Hamilton）保持恒定在 8%。使用孔径为 0.22 µm 的聚醚砜中空纤维（Repligen）截留细胞。生产完成后，剩余的细胞培养液用于测试大型倾斜重力沉降器（Constructions Inoxydables SA），其流量适应 2000 L 灌流生物反应器。在实验过程中，细胞培养液搅拌并保持在 35°C。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 将 pH 控制在 6.95 ± 0.15（InPro3253i，Mettler Toledo），并将 DO 保持在 50%（InPro6860i/12/120/nA，Mettler Toledo）。停止灌流和电容控制。
大规模灌流细胞培养
将 2000 L 生物反应器（Mobius 2000 L 生物反应器，Merck KGaA）以活细胞密度 0.67 × 10^6 cells/mL（mAb1）进行接种，恒定填充体积为 1,500 L。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 将pH 控制在 6.95 ± 0.15（InPro3253i，Mettler Toledo)，DO 维持在 50% (InPro6860i/12/120/nA, Mettler Toledo)。在生长阶段，温度保持在 36.5 °C，一旦达到电容设定点，温度调整至 33 °C。VCV 使用在线电容探针（Incyte Arc）保持恒定在 8%。流量计（LFS-03SU-Z-SC1-G25，Levitronix）用于工艺废弃管线，以监测流量并从总体目标收获率中扣除该量。灌流率在生长期逐渐增加，直到 1.3 RV/day，自此保持恒定到运行结束。通过两个并联的一次性交替式切向流装置（XCell ATF® 10，Repligen）和孔径为 0.22 µm 的聚醚砜中空纤维截留细胞。在每个 ATF10 上通过流量计控制收获流速，并通过重量计算，控制新鲜培养基的添加，以保持生物反应器恒定。
大规模倾斜重力沉降器运行
为了进行性能评估，将倾斜重力沉降器（图 1D）连接到 200L 生物反应器。带有流量计的泵（LFS-03SU-Z-SC1-G25，Levitronix）用于控制重力沉降器的入口流速。校准泵（Serie 520 U, Watson-Marlow）被放置在重力沉降器的底部出口，以确保浓缩的细胞不会返回沉降器。顶部的出口流量由第二个流量计监测。通过将 200L 培养体积加载到倾斜重力沉降器，以与 2000L 生物反应器填充体积、1.3 VVD 灌注率和 18%（470L/day）、23% (600L/day) 和 28% (730L/day) 的废弃率相匹配的操作速度来评估大型重力沉降器的性能。同时，沉降器回收率达到 75% 的目标。
对于大规模评估，倾斜重力沉降器连接在 2000L 生物反应器的废弃管线上，在控制状态下填充体积为 1500L。入口流量（废弃流）由电容探针调节。澄清的回收（重力沉降器顶部）和浓缩废物（设备底部）连接到两个独立的罐中。由于存在不同于 2L 灌流运行的另一个控制系统，因此必须更改控制策略。不是根据工艺废弃流来调整流速，而是将沉淀器上浓缩废物的固定泵速设置为达到大约 70% 的循环率。基于 430L/day的平均过程废弃量，浓缩废弃泵设置为 130L/day。为了稳定工艺废弃流，工艺废弃流的上限设置为 450L/day。
图 1. 废弃液循环设置 (A)、实验室规模声学沉降器 (B)、实验室规模倾斜重力沉降器 (C) 和大型倾斜重力沉降器 (D) 的示意图。
图 6. 实验室规模 2 L 灌流沉降器运行的过程数据与 mAb1 没有废弃循环的标准控制运行的比较。VCV 和活性 (A)、葡萄糖和乳酸浓度 (B)、理论循环率设定点 (C)、氨和 pH 曲线 (D)、工艺收获率 (E)、收获滴度和碎片趋势 (F)、累积收获量(G) 和累积工艺产量 (H)。灰色区域表示执行了废弃循环的工艺阶段，而在白色工艺阶段关闭了废弃循环。
图 8. 针对各种工艺废弃率和循环率的离线大规模 2000L 灌流工艺沉降器评估，显示入口和循环流的 VCV (A)、分离效率 (B)、细胞活性 (C) 和工艺产量增加 (D)。连接到 2000L 灌流运行的倾斜重力沉降器流速的在线实时数据 (E)。
总结和展望
本研究首次将倾斜重力沉降用于稳态灌流过程中的废弃液循环应用，并将其与之前使用的声学分离技术进行了比较。在实验室规模的实验中，声学分离和倾斜重力沉降显示出相似的废弃液循环效率，并且对营养物质、代谢物以及产品质量没有影响。仅用于去除细胞碎片，声学沉降器在去除较小颗粒方面表现出卓越的性能。
出于简化规模放大、降低系统复杂性的原因，倾斜重力沉降是长期稳态灌流废弃液循环所选择的技术。它在 42 天的灌流细胞培养过程中，在实验室规模下进行了测试，然后放大到 2000L 灌流工艺。尽管废弃率存在波动，但开发并测试了自适应自动化策略，以在最佳设定点成功运行沉降装置。
对于 VCV 设置点为 12% 且废弃率在 20% 和 25% 之间的实验室规模的灌流工艺，废物液流最多可减少 3.5 倍，有效废弃率降至 6%，从而提高收获率19%。大型倾斜重力沉降器连接2000L灌流生物反应器，灌流体积为1500 L/day，平均废弃流430 L/day，循环率为70%，持续保持分离效率高于99%。甚至更高的 600 L/day时，废弃流也可被成功浓缩，分离效率超过 94%，这代表灌流运行具有 2000 L 灌流体积以及 23% 废弃率。据作者所知，这是第一次使用倾斜重力沉降器在生产规模上进行废弃液循环。在两种规模上都没有观察到对产品质量的影响。
在考虑使用该技术提高现有或新灌流工艺的工艺产量时，在废弃液循环方面获得的见解为决策提供了合理支持的基础，这些灌流工艺具有特定的目标工艺 VCV、灌流速率和工艺废弃速率。同样，这些知识可以应用于其它用于废弃液循环的新兴技术，例如连续流离心机，只要它们具有合适的尺寸，并允许在灌流细胞培养过程的整个运行期间稳定运行。
