生物制药行业采用各种高通量系统和策略进行生物药生产的早期到后期工艺开发。实验能力的相关提高和材料消耗的减少使高通量工具成为生物工艺开发不可或缺的一部分。虽然这些高通量系统已成功用于生成代表生产规模工艺过程的高质量数据，但它们的数据解释通常需要复杂的数据转换和耗时的系统表征。在高通量纯化开发方面，Repligen 的 RoboColumn 在 Tecan 自动化液体处理系统上运行，提供了卓越的性能可扩展性，但缺乏代表制备层析的优化液体输送系统。特别是，原有液体处理系统缺乏提供高容量连续液体流动和理想线性梯度层析条件的能力。这些局限性会影响蛋白质层析性能并阻碍高通量梯度洗脱实验的应用。

在这项工作中，我们描述了一种基于Tecan Freedom EVO 的高通量纯化工具，该工具可提供更连续的液体输送，从而为 RoboColumn 实验提供连续梯度洗脱能力，如生成高线性电导率梯度实验所证明的那样。结果表明，该工具可以确保 RoboColumn 性能和产品质量数据，这些数据与两种模型纯化方法的更大型、实验室规模层析形式的结果一致。与使用相同优化的 Tecan 系统的分步洗脱方法相比，所描述的梯度纯化方法还在 RoboColumn 和更大的层析柱形式之间提供了更一致的性能。最后，引入了关于不连续流动对 RoboColumn 洗脱性能影响的新见解，这可能有助于进一步改进这些数据在生物工艺开发中的应用。

简介

高通量工艺开发 (HTPD) 工具包含自动化的并行处理系统。与传统的规模缩小模型相比，这些工具使科学家能够提高实验效率并显著减少每次实验消耗的材料。用于下游工艺开发的 HTPD 工具示例包括用于批次结合实验的填料填充滤板、带有层析填料的微量移液器吸头以及填充床微型层析柱。行业已对微型层析柱进行了广泛研究，以确定其在层析生产工艺开发和优化中的潜在用途。微型柱可以在允许更直接地比较和表征微型缩小模型与它们所代表的生产规模的条件下运行。这包括在两种规模条件上的单向流、等效保留时间以及等效蛋白质上样负载。

Repligen 的 OPUS RoboColumn是典型的预装微型层析柱，设计用于与自动液体处理系统结合使用。RoboColumn可以填充购买者选择的层析填料。RoboColumn 的多个应用实例证明，其可用于预测通过台式系统获得的洗脱曲线，包括使用多步梯度来模拟在更大规模下实现的连续梯度。RoboColumn 还被证明可以准确预测产品质量并生成既可预测又可描述生产规模的色谱图。

然而，有一些明显的挑战阻碍了完全采用 RoboColumn 作为更传统的台式规模系统的替代规模缩小模型。这些挑战包括缓冲液和上样应用阶段的不连续液流、需要对所有柱洗脱液组分（例如 pH、电导率、浓度）进行离线分析、缺乏压力数据以及观察到不同规模之间的洗脱体积差异。最近，Benner等人发表的研究表明，观察到的洗脱池体积偏移是由于质量传递行为的差异，即轴向分散，这种差异在 600 µL RoboColumn 和在 ÄKTA FPLC 上以 0.15 mL/min 的速度运行微型柱时可重复发生。然而，在较高的填充床层析柱上并未观察到轴向扩散的影响增加。

RoboColumn与传统层析规模缩小模型之间观察到的差异的另一个重要因素是自动液体处理系统本身的设计。Tecan 自动液体处理系统使用注射泵，从系统水容器或液体处理吸头中抽取。注射器连接到内部容积约为 5 mL 的管道，形成连续的水流路径，气隙通常将水与被吸入或分配的液体隔开。在选择 Tecan 注射器尺寸时必须接受一个主要的权衡，因为注射器无法维持实现某些蛋白质层析分离所需的适当保留时间所要求的体积流速。此外，在低流速下，系统液体和运行缓冲液之间缺乏气隙维护，导致缓冲液与系统液体混合。这些限制导致纯化实验期间的不连续流动。不连续流动会引入非理想流动并增加总保留时间和填料接触时间，这可能会影响预期的层析传质和蛋白质吸附行为。因此，小型层析实验期间的不连续流动可能导致性能不能直接代表传统生产规模工艺，后者使用能够在定义的层析步骤中连续泵送流动相的层析系统进行操作。连续液流的这一挑战最初是通过使 Tecan 液体处理系统连续再生 1 mL 注射泵容量来改进的，允许在管道内抽吸 4 mL 液体并完全分配内容物，而无需从层析柱上移开液体处理吸头。

系统的这一局限性也阻碍了理想线性梯度层析条件的执行。运行缓冲液梯度的能力是工艺开发人员工具箱的重要组成部分。传统上，液体处理系统的这种限制通过在 RoboColumn 上应用缓冲液中的大量逐步变化来生成伪线性梯度来规避。这些模拟梯度的性能已经由许多小组进行了评估，但数据的有效应用似乎依赖于系统的复杂表征、数据转换和/或机械建模。

在这项工作中，我们引入了对 Tecan 原有系统的新改进，该系统允许为 RoboColumn 蛋白质层析操作提供连续洗脱梯度。结果表明，该开发工作优化了 RoboColumn 形式层析柱的性能和产品质量数据，无需数据转换或建模，即可直接与传统的台式形式实验进行比较。所描述的梯度方法允许将生成的高通量纯化数据简单地应用于进一步的工艺开发活动，从而有可能消除为这些目的进行复杂系统表征的需要。液体处理和输送的改进还使我们能够对不连续流动对 RoboColumn 蛋白质纯化性能的影响进行良好控制的研究。这项工作提供了对 Tecan 系统和 RoboColumn 形式特定纯化性能与更传统的实验室规模层析形式相比的差异的独特见解。总的来说，这些发展允许简单地生成和解读与生物制药开发相关的数据。

详细的试验材料、操作和结果，请参考原文。

图 1. OptimizeHTPD CHROM 用户界面的示例屏幕，用于这项工作中纯化实验的的设计和操作。

图 3. 峰吸光度 vs 柱体积，显示Tecan 和 ÄKTA-omnifit 规模上的 50HS 梯度洗脱性能。为 bsAb 1 (a) 和 bsAb 2 (b) 提供了通过读板器方法离线测量的两种柱规模的洗脱峰吸光度重叠。bsAb 1 (c) 和 bsAb 2 (d) 的 Omnifit 规模的标准化吸光度叠加实验由 ÄKTA 检测器在 280 nm 处在线测量，以及由读板器方法测量的 RoboColumn 结果的叠加。基于 Omnifit 规模实验的洗脱梯度的开始显示色谱图的累积 CV。调整 RoboColumn 的 CV 轴以实现定性峰叠加。

图 5. ÄKTA 操作的 50HS Omnifit 和 RoboColumn 的 NaCl 梯度洗脱色谱图叠加显示，左侧 y 轴表示峰吸光度（mAU），右侧 y 轴表示电导率。在 Omnifit（带点的红线）和 RoboColumn（实黑线）上运行的 bsAb 1 (a) 和 bsAb (2) 的 50HS 梯度的峰值吸光度与 Omnifit（虚线）和 RoboColumn（虚线）洗脱期间的电导率一起显示)。根据 Omnifit 规模实验的上样开始显示色谱图的累积 CV。调整 RoboColumn 的 CV 轴以实现定性电导率迹线与 Omnifit 色谱图的叠加。

图 7. Tecan 操作的 MSS 和 50HS RoboColumn 分步洗脱性能在不同液体输送方法下的重现性。显示了使用 OptimizeHTPD 方法 (a) 或 1CV 方法 (b) 并行运行的不同 MSS RoboColumns 的步骤洗脱色谱图，以及使用 OptimizeHTPD 方法 (c) 和 1CV 方法 (d) 的不同 50HS RoboColumns 的步骤洗脱色谱图。

总结

本工作描述了与 Optimize Laboratory Consultants LLC 合作开发的 RoboColumn 高通量工艺开发方法。该方法旨在利用物理修改以及新颖的液体处理控制。研究对 Tecan Freedom EVO 进行了修改，将管路的体积从 4 mL 增加到 12 mL。创建了新的液体类别，能够按顺序吸取 96 步梯度，并提供多达 20 CV 的梯度洗脱。这种结合产生了比先前研究所展示的、更连续的液体输送系统。

使用两种模式双特异性抗体（bsAb）的梯度洗脱纯化实验表明，该方法能够优化 NaCl 梯度洗脱工艺性能和产品质量数据，这些数据可预测更大规模的层析柱形式，而无需进行复杂的数据转换。该方法还展示了改进的 RoboColumn 工艺性能，用于逐步洗脱层析法，与之前公布的方法相比，RoboColumn 和更大规模的 Omnifit 层析柱形式之间观察到的洗脱曲线更具可比性。步骤洗脱工艺的性能不如梯度洗脱那样具有预测性。进一步的研究可能有助于阐明影响梯度和步骤洗脱方法之间蛋白质层析性能的物理机制。本工作中描述的 Tecan 液体输送策略还通过大大减少伪线性梯度所需的缓冲液/样品处理和梯度应用时间来提高 RoboColumn 实验的生产率。

重要的是，这种高通量梯度洗脱工具为高质量数据生成提供了一种更容易获取的形式，这被证明对生物药工艺开发和优化很有用，并可用于其它目的，如工艺表征和机械建模。未来的工作将包括评估操作空间和表征不同连续 Tecan 梯度条件的线性度。正在评估用于测量压力、紫外和 pH 值的入线传感器，以提供有关纯化性能和重现性的更全面信息。入线压力传感尤其可以监测液流连续性，并进一步提高对压力对 RoboColumn 性能影响的理解。入线 UV 和 pH 传感器可以为 RoboColumn 实验提供更多的过程理解和灵活性，并可能为反馈系统提供所需能力。