生产细胞疗法的复杂性和成本，加上它们有希望的临床潜力，等同于需要全面的工艺理解和优化，以便在充满挑战的时间表和不断增加的监管要求中向患者提供高质量的药物产品。实验设计（DoE）是过程分析技术工具包的一个引人注目的组成部分，当在受控实验框架中使用时，可以评估多种因素如何驱动一组定义的结果，从而实现 (i) 改进细胞治疗工艺的理解和/或 (ii) 稳健且可重复的细胞生产工艺优化。在本文中，我们将重点介绍 DoE 在细胞治疗研究和工艺开发中的最佳实践的一些关键考虑因素。此外，DoE 方法在细胞治疗中的应用可能需要定制，以支持此类实验的复杂性，并允许对这些实验进行可靠的建模。

在一个经常出现针对基础生物学的新见解并且产品质量至关重要的领域，令人惊讶的是，可以追溯到 1950 年代的实验工具可能在当下高度有助于将基础研究转化为细胞生物工艺。出于科学家和工程师了解多种因素如何协同作用以推动实验结果的内在需求，实验设计 (DoE) 提供了一种尝试回答此类复杂问题的方法。相比之下，一次一个因素 (OFAT) 方法在细胞治疗研究中特别受欢迎，因为它们允许评估单个因素对给定反应的影响，同时保持所有其它可控变量不变。OFAT 方法的根本缺点是它们可能无法轻易地同时理解多个因素如何驱动给定响应，而 DoE 提供了一种令人信服的方法来做到这一点。

DoE 本质上可能是一项复杂且成本高昂的工作，因此需要深思熟虑和协作的头脑风暴、规划、执行、分析以及验证，以便它可以有意义地帮助细胞治疗工艺的理解和优化。首先，确定有意义地执行 DoE的容量和能力至关重要。其次，必须评估规划和执行 DoE 的实际考虑因素，以确保收集稳健、可靠的数据。最后，可以通过多种方式查看和分析获得的数据，考虑到指导性问题、目标和时间表，所有这些方式都有其优点。在本文中，我们进一步详细讨论每个阶段的一些关键概念以及推荐的最佳实践，希望能激励细胞治疗领域的研究人员考虑在其细胞治疗产品开发中常规性使用 DoE。

DoE概述

DoE 是过程分析技术 (PAT) 工具包的一部分，提供了一种了解多个输入变量（如生长因子、培养基类型或细胞比例）如何驱动特定响应或相互关联的一组响应的方法。虽然大多数细胞生物学实验使用更传统的 OFAT 方法，但 DoE 使实验能够在短时间内提取多种因素对一组结果的影响。例如，在三种浓度下测试四种生长因子的实验需要 81 个条件，这对于细胞培养实验来说不太可行。利用 DoE 方法，这 81 个条件可以减少到更易于管理的规模，即 12-24，从而使实验更加实用，同时保持对要测试的所需因素范围的覆盖。从这些类型的实验中获得的结果可以使用统计软件建模，以确定给定响应的最佳因子范围，然后进一步测试。

有多种不同类型的 DoE 设计，下面概述了其中四种。这四种被强调为经典设计类型，可能在细胞疗法研究和工艺开发的背景下有用。

筛选设计

筛选设计通常用于从较大的集合中识别一系列重要因素。这样的设计可以在真正的 DoE 之前部署，以实现更有针对性的实验。筛选设计在条件数方面通常很小，并且侧重于确定主效应。虽然这些设计的主要目标是识别，但它们在细胞治疗环境中的使用可能会受到限制，因为主要效果通常很好理解，例如，细胞培养基中需要蛋白质来源来支持细胞生长。

全因子设计

顾名思义，全因子设计测试预期设计空间内所有可能的因子组合。在细胞疗法工艺中，他们的最佳应用可能是当某些因素被确定为最重要的几个因素（例如，三到四个）。全因子设计的一个优点是所有因素组合都经过测试，因此可以构建更稳健的响应模型。相比之下，此类设计可以包含大量运行，这对于细胞培养实验而言可能并不总是可行的。

部分因子设计

与全因子设计相比，部分因子设计可以测试设计空间内的某些条件。当然，这种设计类型在实验运行次数有限时最有用，例如，如果起始外周血单核细胞或肿瘤材料的可用性有限。许多假设支持部分因子设计：

• 虽然在整个设计空间中可能存在许多效应排列，例如给定工艺中细胞因子的所有可能组合，但其中只有少数几个是重要的；

• 基本顺序效应（例如单一增长因素）可能比更复杂的效应（例如多个增长因素的组合）更重要；

• 设计空间的一个子部分的全因子捕获仍然可以实现。部分因子设计可以生成预测模型，从而允许数据驱动的迭代。

响应面设计

也许是所列设计中最复杂的设计，响应曲面设计用于在测试因素的背景中对给定响应的曲面和曲率进行建模。如果正在测试可能显示饱和度或曲率的因素，则可以使用此设计。换句话说，如果把设计空间看成一座山，那么最佳反应就是峰顶。例如，用白细胞介素 (IL)-15 持续刺激血源性自然杀伤 (NK) 细胞会产生功能较低、代谢耗尽的细胞，而一段时间的 IL-15 饥饿会显著改善 NK 细胞功能和代谢适应性。类似地，记忆 B 细胞产生免疫球蛋白 (Ig) 需要在培养中使用 IL-21，尽管 100 ng/mL 的 IL-21 似乎并未显著提高超过 50 ng/mL 的 IgM、IgG 或 IgA 产量。

确定有意义地执行 DoE 的容量和能力

在细胞治疗工艺开发的背景下执行 DoE 的前景在一开始可能会让人望而生畏，因此需要在实验工作开始之前进行周密的计划。DoE专家中广泛使用的一句话是“为实验而设计，而不是为设计而实验”。换句话说，DoE 方法的部署应该设法回答一组明确的问题，以便更好地理解所讨论的细胞生产过程。

表 1 概述了在参与 DoE 过程之前需要考虑的一些关键领域。首先，最好明确定义实验目标，尽管也可以考虑可能因此出现的次要目标，并且可能有，例如，对使用类似细胞生产工艺的其它管线项目的附加效应。其次，将实验方法和结果转化至 GMP 生产环境对于确保实验结果用于产品开发至关重要。第三，应审查和调整处理 DoE 实验的内部分析能力，以支持此类实验。最后，需要特别注意的是，如果在上述任何步骤中发现任何速率限制步骤，则应讨论和执行概念验证和/或支持研究的必要性（如果需要），以便未来的 DoE 数据可以有意义地驱动改进工艺理解或优化。

表 1 细胞治疗工艺开发中的 DoE 战略需要考虑的关键项目领域、问题和可能的答案。

规划和执行DoE的实际考虑

在 DoE 规划过程中可能被证明非常宝贵的几个讨论主题值得考虑（图1）。最重要的是，应该就有意义的设计空间以及要优化或进一步了解哪些过程响应达成一致。从更实际的角度来看，这等同于在给定结果集的背景下，哪些因素和因素范围对测试最重要。此步骤可能涉及主题专家 (SME)，并根据需要利用工艺知识和已发表的文献来确定值得测试的关键工艺参数 (CPP) 和材料属性 (MA)。由于细胞疗法生产过程中的 CPP 和 MA 数量巨大，通过一个实验来完整捕获它们可能不可行，因此决定在 DoE 中测试哪些因素对于开展重点研究至关重要。示例可能包括：

• 测试该工艺中使用的一组选定的细胞因子，以提高细胞产量和功能，

• 确定提供所需细胞产品的关键生长因子，目的是降低生产成本或；

• 确定新供应商的最佳培养基、蛋白质来源和添加物比例，以提供与之前运行相当的细胞产品。

突出工艺结果的内在变化或某些 CPP 和/或 MA 重要性的现有数据在 DoE 规划过程中具有重要价值。通过提供称为均方根误差 (RMSE) 的变异度量，现有数据可用于确定拟议 DoE 的统计功效。了解某些 CPP 和/或 MA 的重要性有助于确定合适的设计空间和实验规模。细胞疗法 DoE 的另一个考虑因素是，如果相关的话，如何捕获起始材料的可变性，这在自体和异体细胞疗法中都是至关重要的 MA。例如，重复运行来自多个起始材料供体的相同 DoE 设计可能是捕捉这种变化的适当策略。最后，应选择一种 DoE 方法。这可以从筛选设计（例如确定性筛选设计 (DSD)）到响应曲面法 (RSM) 或全因子设计。或者，一些 DoE 软件还允许定制设计，这可以适应灵活的设计，例如部分因子设计，这可能更适合复杂的细胞培养实验。

重要的是，实验室中的组织对于确保成功执行 DoE 和数据可靠性、以推动有意义的工艺理解至关重要。这些类型的实验最好使用充足的 SME 资源、已建立的半高通量分析方法以及相关的半自动化平台进行。使用 GMP 或 GMP 试剂的研究级变体将进一步确保研究结果可转化为生产环境。还鼓励捕获关键原材料信息、试剂制备、实验设置、细胞收获和配制以及下游分析的支持性过程文件。最后，在单个备份数据库中捕获所有实验数据的方法和数字位置将加快 DoE 分析过程，这将在下面进一步讨论。

利用 DoE 数据的最佳实践

在集思广益、规划和执行 DoE 后，作者鼓励深入评估如何最好地使用生成的数据来实现工艺改进和理解。在某些情况下，建议在项目启动之前计划如何使用数据，尽管细胞疗法生产过程的复杂性和由此产生的数据可能并不总是适合这种方法。作者认为，数据驱动的进展通常在这个阶段最有效。

在（图 2）中突出显示了可以解释 DoE 数据并最适用于后续步骤的几种关键方式。第一个也是最直接的选择是基于逐个条件展开工作，其中在 DoE 中测试的各个条件被用于进一步的验证运行（图 2A）。这里的明显优势是有利条件已经作为 DoE 的一部分进行了测试，从而增加了其结果将在独立实验中复制的信心。要了解测试因素对给定过程结果或结果集的影响，重要的是要确定哪些因素或因素组合在统计上对测试结果有显著贡献（图 2B）。这些信息将是设计后续实验的关键，也有助于加深对工艺过程的理解。最后，采用 DoE 数据的一种耗时但极具洞察力的方法是通过不同的 DoE 迭代来找到 CPP 和 MA 的最佳组合，以产生稳健且可重现的工艺结果（图2C）。在这个过程中，最初的实验可能会产生广泛的响应。通过上述方法分析这些数据可以使重点第二的 DoE 产生更一致的过程结果。DoE 的进一步迭代以及内部技术诀窍可能会被用于找到一个高度优化的因素组合，以推动理想的、高度可重复的过程结果。上述分析选项至少需要按比例进行验证运行，才能实现可靠的生产工艺过程。虽然此阶段存在固有风险，但如上所述，仔细规划、执行和分析将有助于大大降低项目下一阶段的上述风险。

值得注意的是，当一个工艺可能从一个平台转移到另一个平台时，可能需要在使用 DoE 数据方面具有一定的灵活性。例如，小型 G-Rex24 容器非常适合更大的 G-Rex100M 或 G-Rex500M 规模，而 T 瓶中的早期研究或工艺开发过渡到封闭的自动化系统时，例如支持临床试验的Prodigy，可能需要返工或重新确认新的设计空间。尽管如此，一些来自不同平台的 DoE 学习可能首先适用于更大的平台，例如哪些生长因子驱动最佳细胞功能和稳健性，或者哪些过程中指标可能表明生产运行成功。

总结与专家见解

综上所述，本文所述的原则提供了一个框架，通过该框架可以在细胞治疗研究或工艺开发环境中最好地应用 DoE。可以通过 DoE 获得的令人兴奋的数据无疑会推动一定程度的、强有力的科学讨论，这可能违反直觉，对于提炼和调整结果数据如何最好地回答心中的关键问题很重要。可以想象，人们可能会高估 DoE 在短期内可以产生什么，而通过仔细的 DoE 数据分析和迭代实验实现的工艺理解的长期有益影响却往往被低估。部分原因可能是 DoE 在细胞疗法的研究和工艺开发中未得到充分利用。在细胞治疗领域部署 DoE 的通用方法可能并不总是合适的，而是应根据具体情况，寻求一种基于工艺起始材料、所需细胞类型、输入因素、工艺结果和分析能力的定制方法。此外，分析和查询 DoE 数据的多种模式有可能产生无数的生物学见解，其中一些可能不只局限于所讨论的候选疗法或工艺，并可能为发现未来的细胞治疗产品铺平道路。