开发可负担且可获得的COVID-19疫苗的热潮不仅加速了基于病毒载体、mRNA和pDNA的疫苗等治疗模式的研发，而且还向生物工艺界提出了挑战，要求其解决这些重要救命药物生产过程中与规模放大相关的独特挑战。本文阐述了目前的一些想法和经验，以消除瓶颈的潜在挑战，从而将腺病毒载体技术放大至2000 L及以上。

腺病毒载体是将基因递送至特定人类细胞的有吸引力的载体，已被广泛用于COVID - 19疫苗和基因治疗。这些载体可以容纳大的转基因，转导静止和分裂的细胞，并且不整合到宿主的基因组中。越来越多的临床试验基于将腺病毒用作转基因递送载体(用于基因治疗)、疫苗载体以及用作载体(用于溶瘤病毒疗法)。

腺病毒载体技术已经存在很长一段时间了，越来越关注病毒载体生产和开发的关键驱动因素包括降低产品成本(包括大规模生产以及降低原材料成本)的需要以及提高最终产品的纯度水平。

图1. 在2000L规模条件下，生产腺病毒载体的生产流程示意图。

使用HEK 293宿主的生产过程的总体示意图如图1所示，它包括了上游工艺过程中细胞生长和病毒感染阶段的逐级放大，以及下游工艺过程中一系列的过滤、浓缩和层析步骤，以生产高纯度的原料药。

尽管该工艺单元的操作看起来并不复杂，但由于细胞生长不稳定、病毒滴度低、产物聚集、目的产物分离效率低，以及处理大体积病毒感染相关的操作复杂性，大规模生产仍然是一个重大挑战。表1详细说明了工艺规模放大期间预计面临的挑战和可能采取的缓解策略。

表1. 病毒载体规模放大过程中预期的挑战以及潜在的缓解策略。

上游挑战和缓解策略

在大规模生物反应器中以HEK293为基础的病毒载体血清型生产的整体策略围绕三个因素:在放大阶段最优的HEK293细胞生长，在生产过程中获得最优的感染复数 (MOI) 的优质病毒种子以及最优的工艺参数、以获得最高的病毒滴度。

尽管HEK293细胞已被广泛应用于生物制药领域，但选择最佳培养基、补液添加物和工艺参数以避免细胞聚集、细胞生长滞后和活性下降是至关重要的。在生物反应器中，典型的细胞培养参数，如pH、温度和溶氧水平，通常可以得到很好的控制，但与其它常用的哺乳动物细胞类型相比，HEK293细胞的生长对溶氧水平、渗透压、培养基补液策略和代谢物水平表现出更高的敏感性。因此，开发控制这些重要参数的控制策略对于实现一致的细胞生长和产物滴度是非常关键的。

在生产过程中，用于感染HEK293细胞的病毒种子的质量是另一个重要参数，因为它定义了在生产过程中可感染单个HEK293细胞的病毒数量，因此，在病毒滴度方面影响批次产出。要避免的最重要的因素之一是细胞聚集，这可能导致非最佳的生长以及感染效率的损失，从而导致收获结束时生产力的降低。虽然在某些情况下，添加抗聚集试剂可能有助于解决聚集问题，但在大多数情况下，未达到最佳状态的搅拌是根本原因。因此，搅拌速率需要通过设计良好的策略 (P/V、Kla、剪切应力、叶尖速度等) 来优化，以避免任何传质和混合限制，但同时保持低剪切应力。此外，我们需要开发病毒滴度定量分析(显著缩短TAT)来可靠地估算MOI，从而用于计算用于感染的病毒种子体积。

最后，感染阶段的参数，包括温度、最适细胞周期阶段、感染时的细胞密度、感染持续时间和培养的pH值，对收获期末的病毒滴度产量有显著影响。这些参数需要使用多变量设计的实验方法仔细优化，以获得最大的病毒滴度产量。

下游挑战和缓解策略

大规模下游生产的主要挑战是回收产品质量和纯化过程结束时的稳定性不一致。在各种单元操作过程中，pH值、热应力或机械应力均可引起病毒颗粒聚集。这些聚集的颗粒非特异性且“强烈”地结合到填料上，导致重大的产物损失。为了尽量减少聚集造成的损失，整个中游和下游都需要精心设计。细胞裂解、核酸内切酶处理和TFF等单元操作需要优化，以避免剪切力，这可能也有助于降低病毒颗粒的聚集。

层析法被认为是纯化的主要模式，但当与切向流过滤相结合时，其效率可以提高好几倍。在大规模生产中，TFF是一种强大的分离工具，它显著减少了后续层析步骤的产品处理体积以及杂质负荷( 小蛋白、培养基成分和其它不需要的杂质)，从而使层析专注于特定杂质的分离 (如图2所示)。

腺病毒对剪切敏感，在浓缩和换液过程中衣壳的任何构象变化都可能导致高聚集和低回收率，因此优化这一步骤、以使剪切条件最小化是必要的。虽然氯化镁、聚山梨醇酯80和氯化钠等缓冲液中的一些稳定剂可以帮助稳定病毒颗粒，但其它策略与最小化工艺保持时间以及在较低温度下保持工艺中间产物有关。

图2. 使用切向流过滤进行病毒收获裂解液的浓缩和换液，切向流过滤是病毒载体纯化中的关键步骤。

对于病毒载体，另一个可能随着规模放大而加剧的问题是在纯化过程结束时将不需要的空衣壳与包装的完整衣壳(所需产物)进行稳健的分离，以达到所需的空衣壳和完整衣壳的比例。

密度梯度离心机可以有效地将空衣壳与完整衣壳分离，但该技术耗时长，且存在可放大性限制。最广泛使用的层析步骤是阴离子交换，操作接近中性环境，允许在梯度洗脱条件下选择性分离空衣壳。其它层析，如阳离子交换，和膜层析也可以用于获得高度纯化的完整衣壳。

批次间最终产物的不一致性主要是由于下游层析操作中空衣壳和完整衣壳分离不良所致。对离子交换层析单元操作的充分优化有助于完整衣壳的富集，以获得较高的回收率以及最终产品中这两种物质的一致比例。

病毒载体生产的分析工具

开发大规模、优化的病毒载体生产、收获和纯化工艺要求具有准确和可重复的分析工具，以监测质量属性，确保安全、一致、高质量和有效的产品。表2列出了通常用于过程中产物表征和控制的具体分析方法，以确保过程和产物的稳健性。这些分析技术不仅有助于工艺优化 (提高病毒滴度和步骤回收率)，而且是工艺规模放大总体成功的关键指标。

表2. 病毒载体生产中，增强过程理解、缓解规模放大相关挑战的分析工具。

设施设计和适当的清洁控制

由于病毒载体产品的特性，为其精心设计工厂设施是实现可预测和稳健运营结果的关键。腺病毒载体生产的主要挑战之一是过早感染HEK293细胞的风险，这可能导致细胞生长不良和批次提前终止，导致产品产量不理想。因此，根据设计，设施中的不同洁净室需要在人员物料移动、空气处理单元的隔离以及病毒区和非病毒区之间的其它程序控制方面进行适当的控制。此外，还需要建立有效的清洁、卫生和环境监测程序，并辅以产品特异性分析检测，以控制和规避任何病毒污染的残余风险。

总结

随着细胞和基因治疗领域的重点转变为产品的商业化，以解决疾病领域日益增长的需求，生产商开发大规模、稳健的工艺势在必行，这些工艺既要满足严格的监管要求，又要旨在推动全球范围内的可负担性和可及性。然而，具体的技术和操作挑战需要通过精心设计的实验方法和经验知识来缓解，以确保成功的工艺放大。