为了使基因疗法成为更容易获得和负担得起的治疗选择，工艺强化是增加每批次病毒载体产生的剂量数量的一种可能策略。当与稳定生产细胞系结合应用时，可以通过在生产生物反应器中进行灌流来实现慢病毒载体生产的工艺强化，从而无需转移质粒即可显著提高细胞扩增和慢病毒载体的生产。切向流深层过滤用于通过灌流提高细胞密度，并允许慢病毒载体与生产细胞连续分离，来实现强化的慢病毒载体生产。由聚丙烯制成的具有 2 至 4 μm 孔径的中空纤维深层过滤器在用于这种强化工艺时表现出高过滤能力、延长的功能寿命以及慢病毒载体与生产细胞和碎片的有效分离。我们预计，使用 200 L 规模的切向流深层过滤进行悬浮培养的工艺强化，每批次可针对需要慢病毒载体的 CAR T 或 TCR 细胞和基因治疗生产约 10,000 剂，后者每剂需要大约 2 × 10^9 转导单元（TU）。
用逆转录病毒进行基因递送始于 1980 年代，并且一直是一种有用的工具，部分原因是逆转录病毒能够用水疱性口炎病毒囊膜糖蛋白 (VSVg) 进行假型化，以增强稳定性并提供广泛的趋向性。慢病毒载体 (LVV) 已成为基因治疗的有力工具，因为它们可以有效地将前病毒元件整合到宿主基因组中，可以转导非分裂细胞，并且具有低免疫原性。LVV 可用于转导患者 T 淋巴细胞以驱动 T 细胞受体 (TCR) 或嵌合抗原受体 (CAR) 基因的表达，从而治疗不同的癌症。
截至 2022 年初，已完成大约 3,000 项临床试验，另有 597 项正在进行、重复或即将招募的使用 LLV 的临床试验，这证明了细胞和基因治疗领域对 LVV 的浓厚兴趣。然而，这些疗法的成本对许多潜在患者来说是一个障碍，部分原因是与 LVV 生产相关的成本是由一般的工艺产量以及用于瞬时转染工艺所需的质粒 DNA 的高昂成本所引起的。这些生产方面的挑战不仅会影响治疗的成本，还会影响生产满足流行病潜在需求所需的足够剂量的能力。例如，如果不提高每批次的LVV产量或增加生产批次，开发一种对大部分肺癌患者既可用又负担得起的细胞疗法是不可行的，2021 年，仅美国就有约 131,880 人死于肺癌。
成本建模分析表明，通过使用一次性搅拌罐生物反应器 (STR) 以及利用稳定的生产细胞系 (SCL)，可以降低 LVV 生产的商品成本，从而消除了 LVV 中对质粒 DNA 的依赖生产。SCL 的使用提供了通过在单位生物反应器体积中生产更多 LVV 来提高产量的机会，这是通过灌流系统增加细胞密度来实现的。这些技术的利用有可能降低成本，并减少生产占地，同时为细胞和基因疗法提供足够的剂量。值得一提的是，还有其它策略可以增加每批次的生产剂量，例如，提高下游回收率、提高转导效率以及设计旨在提高基因表达的改良转基因盒。
目前，可以通过瞬时转染过程来生产 LVV，通常通过使用与聚乙烯亚胺 (PEI) 复合的四种质粒（env、gag-pol、rev 和目的基因）转染 HEK293T 细胞来实现。 瞬时工艺可以快速生产临床级 LVV；然而，如果在生产中使用 cGMP 级质粒 DNA，这些工艺可能会变得昂贵。另一方面，虽然 SCL 需要技术专长，并且可能需要更长的开发时间，但一旦生成它们，就可以用于 LVV 生产，而无需依赖质粒DNA 和转染。此外，与本研究最相关的是 SCL 的可放大性优势。固有稳定的生产细胞可以在不丢失载体基因组的情况下在培养中扩增，并使用 Tet-On 系统进行诱导，从而消除了生产转移质粒的需要。
可以使用贴壁细胞培养或悬浮驯化细胞培养来实现 LVV 的生产（无论是瞬时转染还是 SCL）。贴壁细胞需要生长基质，以允许粘附和扩散。使用贴壁培养的 LVV 可扩展生产平台包括分层容器（细胞工厂）、固定床生物反应器 (如iCELLis)、中空纤维生物反应器 (如Quantum) 以及微载体（如 Fibra-Cel，与无基质的生物反应器（如摇摆运动反应器 (WAVE) 或 STR）结合使用）。悬浮培养通常与 STR 配对，因为它们不受先前列出的系统基质表面积的限制。
Lesh等人的研究结论是 iCellis (Pall) 固定床生物反应器由于可放大性和易于收获而成为贴壁生产的有利选择，但请注意，不可能在初始接种后直接检测细胞密度。Powers 等人以 0.15 × 10^5 cells/cm2 接种 iCellis，通过在 2.65 m2 生物反应器上使用 Aber Futura 生物量探针进行间接测量，估计收获细胞密度约为 6.8 × 10^5 cells/cm2。 Pall 提供的 iCellis 系统高达至 500 m2；使用 Powers 等人测量的收获密度，这可以支持高达 3.4 × 10^12 cells。就细胞密度而言，这大约是支持悬浮细胞培养的 500 L STR 的两倍，当以 3 × 10^6 cells/mL 的收获密度进行批次模式操作时，这将产生 1.5 × 10^12 cells/batch。每个系统都存在优点和缺点 - 贴壁培养与悬浮培养中的 LVV 输出、大体积收获材料的纯度、易用性、成本和生产占地 - 但显然这两种系统都提供了支持大量细胞以及从而产生大量 LVV的能力；Powers等人估计使用 300 m2低压实系统运行一次 iCellis 可以从一个批次中生产 6,490 剂用于 X 连锁严重联合免疫缺陷 (X-SCID) 的 LVV，假设产量与他们的 2.65 m2小规模模型相当。
灌流 - 通过营养物添加和副产物去除而实现连续的液体交换 - 是考虑用于 LVV 生产的生物反应器选项的另一个因素。 iCellis 系统本质上是一种灌流系统，因为细胞会粘附在固定床膜上，并且能够在不干扰细胞的情况下置换培养基。然而，尚不清楚 iCellis 系统是否可以通过提高接种后的培养基置换率来支持比之前提到的更高的细胞密度。中空纤维膜 (HF) 已与 STR 和摇摆运动生物反应器一起使用，以置换培养基，并支持比通常在批次或补料分批生物反应器中实现的更高的细胞密度。这些膜可以在切向流过滤 (TFF) 或交替式切向流过滤 (ATF) 模式下运行，并已证明能够成功地生成高达 2.14 × 10^8 cells/mL 的细胞培养。
灌流在哺乳动物细胞培养中的好处可以在多个不同的生产领域中找到。在生物制药生产过程中，灌流已用于制备高细胞密度种子库，可在需要接种生物反应器时冷冻和解冻，从而减少整体种子扩增时间。此外，灌流可用于 N-1 生物反应器，这减少了生产（N 级）生物反应器接种前所需的反应器体积。 N-1 生物反应器中的灌流还可以允许以更高的细胞密度进行接种，从而在工厂中节省更多的时间。最后，可以在 N 级反应器中使用灌流来提高产品产量。 单克隆抗体 (mAb)、 腺病毒载体和 LVV 的产量增加已通过利用灌流系统与封闭系统生物反应器的结合得到了证明。
ATF 技术是在哺乳动物细胞培养过程中实现 STR 灌流的既定选择。目前可通过 Repligen 获得，ATF 由许多封装在圆柱形外壳中的管状中空纤维过滤器组成。过滤器孔径大小将决定系统的分类是超滤 (50 kDa) 还是微滤 (0.2 或 0.45 μm)。过滤器连接生物反应器内的导管和系统底部的隔膜泵。流量的方向和速率由控制隔膜中空气压力的控制器决定，从而使细胞培养物交替向上冲程进入生物反应器，然后向下冲程返回设备；这种交替的切向流通过去除过滤器表面积聚的杂质来促进自清洁。滤液管线位于包裹的中空纤维束的外侧。从反应器中移除的速率要么根据预定的灌流速率设置为常数，由细胞特异性灌流速率 (CSPR) 决定，要么设置为在生物反应器系统中保持恒定的重量，同时以恒定的速度添加培养基，即由 CSPR 确定。
一种正在探索的新过滤技术是 Repligen 的切向流深层过滤 (TFDF)，与 ATF 相比有几个关键区别。 TFDF 是管状聚丙烯过滤器，壁厚约为 5 mm。相比之下，ATF 中空纤维聚醚砜膜的厚度约为 0.075-0.2 mm。 TFDF管腔由各向同性材料制成；结合其厚度，该过滤器允许延长曲折的通道路径，直径约为 2–4 μm，颗粒必须穿过这些通道才能进入滤液端。 ATF 中空纤维是一种各向异性材料，用作绝对截止过滤器，50 kDa，0.2 μm，或最大的产品，0.45 μm。深层过滤与 TFF 的结合使 TFDF 具有更高的过滤容量，同时避免生物产物滞留在过滤器内。 TFDF 系统在没有交替流动的情况下运行：低剪切泵通过生物反应器内的两个导管在一个方向上通过过滤器循环培养物，并且滤出液同样通过蠕动泵基于恒定速率从过滤器外壳中去除，或通过重量控制自动调节。
两种灌流技术之间的材料差异使它们可以应用于不同的模式和不同的产品类型。当使用超滤时，单克隆抗体，如 IgG1， 可以被 ATF 中空纤维截留，但如果系统切换为使用微滤中空纤维，产品可以在滤出液中连续收集。根据我们的经验，微滤 ATF 膜会截留 LVV（数据未显示），后者直径约为 100–120 nm，而 TFDF 明显较大的孔结构已被证明允许 LVV 自由进入滤出液。
Oxford Biomedica 已经证明，TFDF 技术可用于从 HEK293T 细胞中分离LVV，并可扩大规模，以进行批量过滤。初步实验表明，可以使用单个 55 cm2 TFDF 过滤器和单个生物反应器，进行多次 5 L 批次收获，方法是在初始收获后将培养物重新悬浮在新鲜培养基中。他们还将这项技术与市售深层过滤器进行了比较，结果表明 TFDF 收获物的产量更高。最后，他们成功地将他们的工艺从 5 L STR 扩大到了 50 L STR。
TFDF 的优势在于其在灌流支持下从高细胞密度培养物中进行连续收获的潜在应用。前面的例子有效地展示了 HEK293T 与 LVV 的分离；然而，该系统用于 1 小时的批次收获，而不是连续分离。很可能在收获之前没有使用灌流，并且不清楚收获密度是多少，因为它们未公开。我们试图通过灌流和连续收获，来测试该过滤器对工艺强化的有用性。
我们报告了在灌流系统中以高细胞密度（>20 × 10^6 cells/mL）从 SCL 连续生产和收获 LVV，这是通过使用 TFDF 实现的。在这项研究中，过滤器最初在低细胞密度 (LCD) 下进行评估，以验证 Oxford Biomedica 报告的发现。已经开发出一种使用 ATF 技术的灌流工艺，该工艺将 LVV 与生产细胞一起大量浓缩，并将收获限制为在诱导后 48 小时 (hpi) 进行的单批次收获。使用 TFDF 实现的灌流允许从高细胞密度培养物中连续收获和分离 LVV。因此，从生物反应器中收集 LVV 成功地实现了高达 96 hpi，这是使用 ATF 技术通过单批次收获实现的生产时间的两倍。
详细实验操作和结果，请参考原文。
图 1 低细胞密度 TFDF 收获结果
图 2 所有运行的活细胞密度 (VCD) 和活性 vs. 运行的时间（天）。
图 3 使用 TFDF 的高细胞密度灌流：浊度和跨膜压。
图 4 使用 TFDF 的高细胞密度灌流（仅运行 2）：颗粒浓度和渗透率百分比。
图 5 使用 FlowCam 8000 测量并取自 TFDF 运行 2 的滤出液和生物反应器样品的颗粒直方图
图 6 针对反应器、在线滤出液和原液袋样品，高细胞密度 (HCD) p24 (pg/mL)、ddPCR 感染滴度 (TU/mL)、宿主细胞蛋白 (HCP) (ng/mL) 和双链 DNA (ng/mL) vs. 时间（天）。
图 7 使用 TFDF 的高细胞密度灌流：估计的慢病毒载体产量。
结论
TFDF 膜的初步评估作为概念证明进行，旨在使用单个 2 L 生物反应器回答几个问题。主要重点是了解和量化通过过滤器的 LVV 产量，确定典型工艺通量下的膜载量，并评估从单个生物反应器进行多次收获的可能性。为此，我们使用尺寸过小的过滤器 (3 cm2) 来达到基于最大负载的过程终点。
先前的研究报告说，使用 55 cm2 TFDF 膜和 5 L 生物反应器进行的两批次收获具有良好的 LVV 产量，细胞密度和 LVV 滴度未公开。最初选择这些条件是因为它们代表了最佳工艺参数，导致收获时间略低于 1 小时，每次收获的通量为 909 L/m2。 在我们的实验中，我们报告了高过滤器载量是由于 3 cm2 过滤器的尺寸配备 2 L 生物反应器。两批收获的总和超过 11,000 L/m2，48 hpi 收获约为 6,170 L/m2，96 hpi 收获约为 5,200 L/m2。尽管在 96 hpi 收获时 TMP 接近 5 psi，表明膜逐渐污染，但第二次收获成功完成，否则正常流量深层过滤将无法实现。在实践中，可以通过选择更大的单位体积过滤面积来避免这些高压；但是，在扩大生产规模、以降低生产工厂的成本和设备尺寸时，了解过滤器载量至关重要。
LVV 产量的评估也令人鼓舞。对于 48 hpi 的收获，确定了几乎完全的 LVV 回收率，这是对市售深层过滤器的改进，通常获得的澄清率在 75% 和 90% 之间。虽然对于 96-hpi 收获，发现滤膜发生了一些损失，考虑到膜被推到其最大过滤载量，这并不完全令人惊讶。如果增加每个收获体积的过滤面积，我们将再次期望提高第二次收获的产量。此外，我们决定在 48 hpi 收获后断开过滤器并将其内容物排入反应器，并在开始 96 hpi 收获之前重新灌流过滤器。在观察过滤器在后面的灌流实验中长时间运行的能力后，如果重复多批次收获，我们可能会决定不对膜进行排液和重新灌流。或者，我们可以让膜在 48 hpi 到 96 hpi 的条件下再循环，而不运行滤液泵，然后在准备第二次收获时简单地打开泵。我们认为这可能是一种更好的方法，因为切向流对膜的自清洁作用有益；此外，该操作的劳动力要求较少。需要额外的实验来确定扩大具有多批次收获的工艺的好处。
对于 LCD 细胞培养（例如，非灌流批次工艺），TFDF 似乎是将 LVV 从宿主生产细胞中分离出来的有效膜。虽然我们故意使 3 cm2的过滤器过载，但更实用的批次工艺可能会以 2-2.5 的安全系数运行，并尝试将总工艺时间保持在 1-2 小时左右。如果在这些限制范围内开发一种工艺，可以使用 50 cm2 的膜来培养 10 L，450 cm2 来培养 100 L，2,100 cm2 来培养 500 L，过滤面积分别Repligen 提供的实验室、中试和生产规模 KrosFlo 产品匹配。理论上，使用他们最大的 6,000 cm2 过滤器可以在 2,000 L 下执行两次收获过程，但根据我们的结果，这会将工艺时间推至大约 3 小时，并使用约 1.3 的低安全系数。然而，应根据每个生产细胞系的具体情况进行详细评估，以确定可接受的公差范围。
在最初的实验证实之后，我们试图评估 TFDF，以便使用我们的 SCL 实现灌流，以获得传统批次工艺形式的强化版本。观察到的处理量表明过滤器也可能适用于此应用程序并支持更高的细胞密度培养。过去的实验是利用 0.2 和 0.45 μm ATF 中空纤维进行灌流；然而，在滤液中只有微量的 LVV（p24 和 ddPCR 小于 1%）。使用 ATF 的灌流时，LVV 必须在诱导后一段时间后以批次形式从生产细胞中分离出来；因此，ATF 的目的是促进细胞扩增到比没有灌流时可能达到的密度高得多的密度。通过使用 TFDF，我们预计除了能够在诱导前将培养扩增到更高密度外，还能够从生产细胞中连续分离 LVV。
TFDF 实际上可以通过灌流将培养扩增到更高的密度，并且与 ATF 中空纤维相比，似乎没有任何区别。诱导前，培养平均达到 37.1 × 10^6 cells/mL，活性≥95%；在我们的案例中，可能可以实现更高的密度，但每天需要更多的生长培养基。我们的工艺限制在每天大约 3 个罐体积（VVD)，以避免对该工艺的潜在放大版本提出不切实际的培养基要求。因此，进一步放大将面临必需营养素缺乏的风险，可能会影响生产细胞的 LVV 生产。
我们着手通过量化滤液和反应器浊度、TMP 以及粒径和浓度来表征过滤器的性能。所有技术都表明 TFDF 膜可以有效地将 LVV 从生产细胞和细胞碎片中分离出来。如图 S1 所示，除了运行 1 在线滤液样品外，滤液中的浊度始终小于测量的反应器浊度的 2%。对于运行 1 ，我们强烈怀疑在提供的单向阀采样端口（位于 TFDF 过滤器外壳的滤液侧）上使用注射器快速抽取采样的行为导致人为高于设定点的通量（90 LMH）。在诱导后 2、3 和 4 天，运行 1 的在线滤液浊度均高于任何批次收获浊度。如果在线浊度实际上具有代表性，我们会预期批次收获液中会有更大的浊度。出于这个原因，我们建议不要使用注射器端口进行在线采样，并使用 Y 型连接器收集到无菌样品瓶中，就像我们第二次和第三次 TFDF 运行所做的那样。总的来说，浊度降低是一致的，并且在将浊度突破定义为滤液浊度相对于反应器浊度的增加时，直到诱导后 4 天都没有观察到突破。
图 3C 中的低 TMP 和此测量值的线性增加还支持我们观察到发生了最小的颗粒突破。对于突破事件，我们可能期望 TMP 过渡到非线性阶段，表明过滤器内有明显堵塞，这通常会导致更高比例的颗粒突破。相反，TMP 的快速下降可能表明过滤器受损，不再能够截留大颗粒。深层过滤提供了一个独特的优势，与片式过滤器相比，它通常可以提供更高的容量，因为它允许颗粒被捕获在其通道内，而不会完全阻塞通过同一通道的液体流动。 TFDF，正如其恰当的名称所示，结合了 TFF 的这一优势，有助于剪切膜表面，以最大限度地减少过滤器内的颗粒沉积。因此，TMP 逐渐线性增加，诱导后最多 4 天的所有运行均不超过 0.5 psi (>8,000 L/m2)，这是 LVV 与细胞碎片成功分离的积极迹象。
我们最后一种表征过滤器的方法是量化反应器中的颗粒浓度和大小，并使用液流成像直接观察滤液，据称其成像范围为 2–50 μm（尽管某些颗粒在 <2 μm 处被检测到）。我们发现，即使是 FlowCam 可检测到的最小颗粒也能被 TFDF 有效阻挡（图 4 和 5），并且在诱导后长达 4 天的时间里，观察到的滤液颗粒尺寸没有显著增加。这一观察再次支持我们使用 TFDF 膜从细胞碎片中有效分离 LVV 的结论。
到目前为止，在我们的讨论中，我们强调了支持细胞和细胞碎片截留在膜的回流侧的数据。为了总结 LVV 从生产细胞和碎片的有效分离，我们在图 6 和图 7 中通过 ddPCR 量化了 p24 浓度和感染性滴度，以证明实现了高 LVV 回收率。首先，在图 6 中，很明显，在相对于反应器的滤液中测量到了可比的分析标记；我们在图 7 中的产量计算量化了这些结果，并得出结论，在我们的收获液中获得了几乎完全回收的 LVV。因此，我们已经证明 TFDF 膜在从生产细胞和反应器中存在的绝大多数碎片中分离 LVV 方面表现良好。
该工艺的一个观察到的缺点是 LVV 的感染性随着时间的推移在诱导后明显降低；然而，这个问题与 TFDF 过滤器无关，可以归因于 SCL。已知使用 VSVg 假型化的 LVV 对生产细胞具有细胞毒性。如图 6 所示，感染滴度和感染性均出现明显下降。前者在 LVV 生产的拐点后减少，大约 48 hpi，而后者从诱导开始减少。对于我们的生产细胞系，从诱导后第1-2天、第2-3天以及第3-4天，收获的总TU平均为 42.5%、37.4% 和 17.2%。如果放大具有这些特征的工艺，则应执行成本效益分析，以确定收获窗口以及第 3 天之后的收获是否有利。此外，需要进一步表征，以评估从诱导后很长时间收获的纯化 LVV 产品是否具有足以用于患者的质量属性，特别是相对于诱导后直接收获的具有更高感染性的产品。具有较低感染性的馏分可能需要更高的感染复数 (MOI)，从而需要更高的细胞和基因治疗剂量。我们想提一下，我们怀疑通过增强生产培养基、载体构建设计和假型化以及克隆选择对上游工艺的进一步优化可能会导致生产细胞系得到改进，从而增强在诱导后延长的生产时间内产生具有更一致感染性的 LVV 的能力。
我们对由 ATF 或 TFDF 支持的强化灌流工艺与标准批次工艺进行的比较表明，使用当前可用的过滤技术可以获得显著的生产收益。如表 1 所示，与非灌流批次生产相比，ATF 或 TFDF 工艺都允许将生产细胞的密度提高一个数量级，并且可以获得几乎相同的 LVV 产量增加。拥有 SCL 可以使这些强化工艺变得可行并最终具有成本效益；由于不需要转移质粒，因此只需通过从生长培养基切换到生产培养基来诱导培养，以启动 SCL 的基因表达，从而生产细胞的LVV组装和出芽。 TFDF 提供了从生产细胞中连续分离 LVV 的额外好处，与 ATF 强化工艺相比，这导致每批次的 TU 增加近 2 倍。 TFDF 强化的这种生产收益是一个好处，因为不需要终止培养来分离 LVV，而这是 ATF 工艺所必需的。
在比较 TFDF 和 ATF 强化工艺时，应强调进一步的优点和缺点。虽然我们强调可以通过使用 TFDF 扩增诱导后细胞的策略来提高产量，但另一个好处是不需要二次分离步骤：TFDF 用作促进灌流的工具，同时用作第一步分离。对于 ATF ，由于 LVV 截留在生产细胞的回流液中，因此需要二次单元操作来执行类似的分离。例如，离心或深层过滤步骤可用于此分离；然而，这是一笔巨大的成本，并且会在生产环境中占用额外的空间。 ATF 和离心机配对可以可行地允许从灌流强化反应器中进行多次收获；然而，还需要进一步的开发来确定 ATF 如何在多次收获中保持润湿状态和功能，以及如何将细胞沉淀从离心机返回到生物反应器中进行培养基再悬浮。
虽然上述优点适用于 TFDF，但它并非没有缺点。主要缺点是单位体积输出，其中包含 LVV。我们每天生产了大约 3 VVD 的滤液，如果收获 2 天或 3 天的滤液，则分别相当于 6 或 9 个罐的总体积。虽然 ATF 需要与 TFDF 相同数量的培养基，但在收获时，含有 LVV 的上清液只是一个罐体积。因此，它们的后续下游工艺看起来几乎等同于非灌流批次工艺，而 TFDF 形式需要某种形式的体积浓缩或将滤液收集在相对于生物反应器体积更大的储罐中。前者将是首选，因为考虑将 TFDF 用于连续生产的人可能会对从批次生产切换到连续生产时通常实现的占地减少感兴趣。
为了进一步阐述这一点，可以围绕 TFDF 设计一个真正的连续工艺，以进一步减少生产占地，并与批次相比，更快地从生物反应器中分离和纯化 LVV。这提供了提高产品质量和产量的潜力，因为已知 LVV 对温度敏感，因此不能长时间保存。单程 TFF (SPTFF) 是一种选项，可用于将 TFDF 滤液的体积减少到后续纯化步骤的实用水平。另一种选择是多柱层析法 (MCC)；在这种情况下，TFDF 滤液可以通过预过滤器并连续上样到在上样、洗脱和再生阶段之间交替的柱上。这两种选择都需要对 LVV 生产进行进一步评估；然而，它们目前对生物制药生产都特别有吸引力，以提高生产率，并减少占地和成本；因此，这些技术的前景可扩展到细胞和基因治疗以及 LVV 的生产。
用于 LVV 生产的灌流强化工艺的发展引入了为大量患者群体提供足够 LVV 剂量的可能性。如果我们做出几个假设，我们就可以开始估计可以以商业规模生产的剂量数。这些初始假设包括适度的 20% 下游收率，ddPCR 的总 TU 大约是功能滴度的 5 倍，并且 2 L 规模的工艺可以有效地扩大到 200 L。如果我们进一步假设所需的剂量对于假设的 TCR 和 CAR-T 疗法，每位患者是 2 × 10^9 TU，对于假设的造血干细胞 (HSC) 基因疗法，是 2 × 10^10 TU，则200-L 批次、ATF灌流和 TFDF 灌流将分别产生 900、12,000 和 24,000 剂，用于 TCR 和 CAR-T 疗法，而 HSC 基因疗法则低一个数量级。虽然每种单独的疗法都将取决于经验确定的 MOI，并且每个工艺的产量都会有所不同，但这个例子证明了在不久的将来使用 LVV 进行细胞和基因疗法治疗大量患者群体的可能性。
