来自REGENXBIO Inc.的研究人员近日发表了题为“Advances in Recombinant Adeno-Associated Virus Production for Gene Therapy”的文章。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

重组腺相关病毒 (rAAV) 是用于递送遗传物质、以进行基因治疗的主要载体，但其低产量和产品质量导致高生产成本，目前，这仍然是该领域的主要挑战。在本文中，我们总结了常用平台的最新进展，包括 HEK293、杆状病毒、HSV 和基于 HeLa 的 rAAV 生产方法。文章详细介绍了提高产量和产品质量的每种方法和策略的优势和主要挑战。

近年来，基于 rAAV 的基因治疗获得了很多关注，因为它具有几个理想的属性，包括缺乏致病性和低免疫原性。基于 rAAV 的载体靶向分裂和非分裂细胞，包括视网膜、肝脏、心脏、肌肉和中枢神经系统 (CNS)， 允许治疗基因的长期表达。迄今为止，已针对各种疾病进行了 200 多项临床试验，例如血友病 A 和 B、帕金森病、湿性年龄相关性黄斑变性、粘多糖贮积症 (MPS)、巴顿病等。2012 年，开发用于治疗反向脂蛋白脂肪酶缺乏症 (LPLD) 的脂基因tiparvovec 成为欧洲第一个获批的基因治疗药物。之后，另外2种基因治疗产品获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括 2017 年批准 voretigene neparvovec ，用于治疗 Leber 先天性黑蒙，以及2019年批准onasemnogene abeparvovec，用于治疗脊髓肌肉萎缩 (SMA)。

尽管基于 rAAV 的基因疗法的临床试验取得了成功，但由于产量低以及某些疾病适应症的高剂量需求，高生产成本仍然是基因治疗领域的瓶颈。Onasemnogene abeparvovec 单剂量治疗费用为 210 万美元，是美国市场上最昂贵的药物之一。另一个例子是，治疗 X 连锁肌管肌病 (XLMTM) 需要每公斤 10^14 载体基因组 (vg/kg) ，每个患者至少需要 10^15 vg。尽管最近的工艺和技术发展已将产量提高到 10^11 至 10^12 vg/L，并降低了商品成本，上游产量仍不足以满足XLMTM等疾病的大剂量需求。

腺相关病毒生物学

野生型腺相关病毒 (AAV) 是 Atchison 等人于 1965 年偶然发现的，即电子显微镜观察到了腺病毒制剂中 包含的25 nm 小污染性颗粒。它需要腺病毒进行复制，后来被分类为无囊膜病毒的细小病毒科。野生型 AAV 包含一个 4.7 kb 的单链 DNA 基因组，跨越2个主要开放阅读框 (ORF)，两侧是两个 T 形反向末端重复序列 (ITR)（图 1）。反向末端重复具有复制蛋白结合元件 (RBE) 和末端解析位点 (TRS)，其参与复制、衣壳中的基因组包装和长期细胞内持久性。第1个开放阅读框 (rep) 包含 P5 和 P19 启动子，并通过可变剪接编码4种复制蛋白（根据分子量，命名为 Rep78、Rep68、Rep52、和 Rep40 后的分子量）（图 1）。Rep78 和 Rep68 的表达受 P5 启动子的调节。它们是 DNA 复制、位点特异性整合、基因表达调控以及从宿主基因组中切除所必需的。P19 启动子调控 Rep52 和 Rep40 的表达。Rep52 和 Rep40 都具有 3' 到 5' 的解旋酶活性，对 AAV 基因组包装很重要。第2个开放阅读框（帽）包含 P40，1个控制3个衣壳蛋白亚基（即 VP1、VP2和VP3）表达的启动子，后者分子量分别为 87、72 和 62 kDa。VP1、VP2 和 VP3 的羧基末端蛋白质序列相同。

图1. 野生型AAV2基因组组织。AAV2基因组是单链DNA (4.7 kb)，有2个主要的开放阅读框，两侧是T形倒置末端重复序列。P5和P19启动子驱动两个rep转录本的转录，这2个转录本经过选择性剪接 (曲线)，导致2个大的rep蛋白 (Rep78和Rep68) 和2个小的rep蛋白 (Rep52和Rep40) 的表达。P40启动子控制cap转录本的转录和表达。可选的剪接 (曲线)，使用非传统的开始密码子，和移位的开放阅读框导致5种不同的蛋白质的表达。这些蛋白包括3种衣壳蛋白 (VP1、VP2和VP3)、组装激活蛋白 (AAP) 和膜关联蛋白 (MAAP)。p81启动子转录并控制基因X的表达，该基因可能参与AAV的复制。RBE：Rep结合元件；ITR：反向末端重复；Ploy (A)：聚腺苷酸化信号；TRS，终端解析点。

衣壳蛋白以 1:1:10 的比例 (VP1:VP2:VP3) 由2个交替剪接的 mRNA 产生，组装由 60 个病毒蛋白亚基组成的衣壳。来自 P40 启动子转录物的次要剪接 RNA 变体包含 VP1 翻译起始密码子 (AUG)，这解释了其与 VP3 相比较低的表达水平。虽然主要剪接 RNA 变体包含 VP2 和 VP3 的翻译起始位点，但后者的翻译是从传统的 AUG 起始密码子开始的，而前者是从一个非常规的 ACG 起始位点产生的，该位点经常被跳过并导致 VP2 表达降低（图 1）。VP1 的 N 末端还含有以磷脂酶 A2 (PLA2) 为代表的酶活性，这是 AAV 从内体逃逸所必需的，并包含核定位信号 (NLS)。帽区域还包含一个移码开放阅读框，编码组装激活蛋白 (AAP) 的非常规密码子 CUG，在 VP 亚基蛋白转运至核仁区室和衣壳组装过程中，该蛋白在大多数 AAV 血清型中起重要作用。据报道，AAP 蛋白与衣壳蛋白的保守 C 末端相互作用，并作为组装支架发挥作用。在帽区域还鉴定了另外2个开放阅读框，编码蛋白 X 和膜相关辅助蛋白 (MAAP)。虽然它们在 AAV 生物学中的确切功能仍不清楚，但它们可能分别参与增强 AAV 的复制和分泌（图 1）。rAAV 仅包含来自野生型病毒的 ITR，而复制和衣壳化的基本元素（rep 和 cap）被目的基因的表达盒替换。

当前的重组腺相关病毒 (rAAV) 生产平台

本文将讨论5个主要生产平台，在 rAAV 质量、产量、实施速度和可靠的可放大性方面，每种方法都有自己的优点和缺点。最广泛使用的平台之一是用于 rAAV 生产的 HEK293 细胞瞬时转染。其它常用的平台包括杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 和基于 HeLa 细胞的系统，主要是因为它们可直接进行大规模生产。另一个众所周知的系统基于单纯疱疹病毒 (HSV)，它也可为 rAAV 生产提供直接的可放大性。最后一个平台涉及在无辅助病毒系统中使用 HEK293 细胞或其它细胞类型进行稳定的细胞系开发，而不在生产中使用腺病毒、BEVS、HeLa 或 HSV；这已成为最近的热门话题，并取得了实质性进展。

为了克服当前 rAAV 生产平台面临的瓶颈，多个研究小组已经探索了使用替代宿主进行 rAAV 生产的可行性，例如E.Coli和酿酒酵母，其拥有完善的蛋白质生产平台，商品成本低。最近的一项研究表明，AAV2 VP3 衣壳亚基可在E.Coli中表达并成功组装，具有与通过HEK293 瞬时转染工艺产生的 rAAV2 相似的物理和生化特性。由于缺乏适当的蛋白质折叠和翻译后修饰, 其它研究小组探索使用酿酒酵母作为另一种生产 rAAV 的替代方法，并简化下游工艺。使用编码 Rep78、Rep52、衣壳 VP1、VP2、VP3 和 AAP 的4种质粒转化酵母细胞，研究小组观察了到 rAAV 的正确组装，但与更发达的 Sf9/杆状病毒系统产生的 rAAV 相比，完整颗粒百分比和感染性较低。酵母系统的未来研究重点是识别参与衣壳组装、AAV 复制和包装的酵母宿主因子，这将有助于开发更好的酵母系统，实现更具可放大性和成本效益的AAV生产。

基于 HEK293 的 rAAV 生产系统

rAAV 最初是通过瞬时转染3种质粒生产，其携带在 HEK293 或 HEK293T 宿主细胞中组装 rAAV 的必需基因，细胞稳定表达腺病毒 E1A 和 E1B 基因的转染 DNA，支持 AAV 复制。虽然与 HEK293 细胞相比， HEK293T 细胞具有更快的生长速率以及更好的可转染性，且rAAV 产量更高，但SV40 T 抗原肿瘤蛋白的存在会导致安全风险。来自 E1A 的编码蛋白通过反式激活 P5 和 P19 启动子来增加 rep 表达。除了编码 rep 和 cap 的第2个质粒和包含2侧含有2个倒置表达盒的第3个质粒之外，在1个质粒上提供其余的必要腺病毒辅助基因（E4、E2A 和病毒相关 (VA) RNA）末端重复序列 (ITR)，防止 rAAV 生产过程中的腺病毒污染（图 2A）。

图2. 基于HEK293的rAAV生产平台。每个平台的简化rAAV生产工作流程，展示rAAV生产中涉及的每个基本步骤。(A) 三质粒转染。(B) 两质粒转染。(C) 基于四环素的自沉默腺病毒 (TESSA载体)。总结了每种工艺的优点和挑战。GOI：目的基因；ITR，反向末端重复。

A）三质粒转染：优势：1- 最常用于工业，2- GMP质粒生产时间短，3- 临床实施速度快，4- 无需腺病毒；挑战：1- 商品生产成本高，2- 规模放大挑战，3- 质粒材料的一致GMP生产。

B）两质粒转染：优势：1- GMP质粒生产成本降低，2 - 临床实施速度快，3- 无需腺病毒；挑战：1- 规模放大，2- 质粒材料的一致GMP生产。

C）TESSA载体：优势：1- 可规模放大，2- 提高rAAV产量；挑战：1- 需针对每个项目制备TESSA载体，延长了时间线，2-需要从生产批次中去除残留的腺病毒。

传统上，贴壁 HEK293 细胞被用于 rAAV 生产的三质粒转染方法，这为初步临床试验产生了足够的 rAAV。行业已经开发了一些新方法，以从贴壁 HEK293 细胞转移到无血清悬浮培养。这种驯化工作规避了贴壁瞬时转染技术规模放大的挑战。

腺相关病毒是一种依赖型细小病毒，需要多种宿主因子和辅助病毒提供的必要基因才能复制。除腺病毒外，还鉴定和表征了几种辅助病毒，以支持增殖，例如针对哺乳动物细胞生产的单纯疱疹病毒、牛痘病毒、针对昆虫细胞生产的杆状病毒。Wang 等人发现，人博卡病毒 1 (HBoV1) 是 AAV2 复制的新型辅助病毒，AAV2 复制的最低要求包括 HBoV1、NP1 和 NS4 非结构蛋白，以及病毒长链非编码 RNA (BocaSR)。同一团队的一项研究表明，将人博卡病毒辅助基因（NP1 和 NS4）与腺病毒辅助必要基因（E4、E2A 和 VA RNA）相结合，在三质粒瞬时转染方法中，获得的产量大约是单独使用腺病毒辅助质粒的2倍.

三质粒转染系统已经非常成熟，通常用于临床和商业化生产。几个研究小组试图引入双质粒系统，以缩短生产 GMP 产品所需的时间，并降低产品成本，同时简化瞬时转染工艺（图 2B）。Grimm 等人引入了第1个双质粒表达系统，他们在其中设计了一种新的包装/辅助质粒 pDG，以包括 AAV 复制、衣壳形成和辅助功能所需的rep、cap、E4、E2A 和 VA RNA 基因。在该质粒中，p5 启动子被诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV) 启动子取代，以削弱 Rep 蛋白表达。用 pDG 质粒和转基因载体质粒共转染细胞足以产生 AAV。作者报告说，这种双质粒系统产生的 AAV 滴度比传统的三质粒转染系统高 10 倍。使用类似的方法中，Tang 等人对 pDG 质粒的骨架进行了进一步修改，以创建包括rAAV 生产所需的基本腺病毒辅助基因之外，包含 AAV rep 和 cap 的 pQT 包装质粒。他们使用不同的 AAV 血清型（包括 AAV1、AAV5、AAV8 和 AAV9），将 pQT 系统与传统三质粒系统进行了比较，发现 pQT 系统的功能与三质粒转染系统相似，并且对于GMP生产，在速度和成本效益方面更灵活。

最近，Su等人介绍了一种适合规模放大的、自衰减腺病毒系统，与传统的瞬时转染方法相比，该系统使一系列血清型的 rAAV 产量提高了 10 到 30 倍（图 2C）。在这个系统中，研究人员能够通过打开/关闭负责 rAAV 生产和腺病毒结构蛋白表达的辅助功能的早期和晚期时间阶段，从而控制辅助腺病毒的生命周期。这是通过插入四环素操纵子 TetO 来设计腺病毒主要晚期启动子 (MLP) 而实现的，TetO 可以用主要晚期启动子表达的 TetR 阻遏物来抑制。这种设计创造了一个负反馈回路来调节腺病毒结构基因的表达，这些基因由多西环素存在与否控制。rAAV 生产是通过用基于四环素的自沉默腺病毒（TESSA 载体）感染 HEK293 细胞来实现的，提供具有辅助功能的早期基因表达，其中稳定掺入侧翼为 ITR 的 AAV 转基因，同时提供在同一区域含有 AAV rep和cap基因的第2个 TESSA 载体。尽管该系统显示出比传统的三质粒转染更高的 rAAV 产量并且可以规模放大，但仍然有低水平的腺病毒污染。这可能是由于强力霉素调节启动子的固有渗漏性。此外，研究已经表明，在没有腺病毒主要晚期启动子 (MLP) 的情况下，一种腺病毒纤维蛋白以非常低的水平从隐蔽启动子表达。在下游工艺过程中可以完全清除残留的腺病毒污染，以确保安全。

新技术将进一步实现瞬时转染的可放大性并提高 rAAV 质量，例如使用无质粒瞬时转染和纳米质粒平台。除了实施无质粒平台外，其他研究人员还在探索支持高转染效率以及在大规模生物反应器中获得高生产率的新型转染试剂。

原文：P.Liu, A.Mayer, Advances in Recombinant Adeno-Associated Virus Production for Gene Therapy. American Pharmaceutical Review, 2022.